Ферменты - Аскорбатоксидаза винограда

Этот фермент (O2-оксидоредуктаза К.Ф. 1.10,3.3) широко распространен в растениях. Он относится также к медепротеидам.
Ферментативное окисление аскорбиновой кислоты было изучено довольно детально, особенно в растительных объектах. В настоящее время утверждают, что хотя существование специфической аскорбатоксидазы можно считать доказанным, но все же, кроме нее, имеются и другие ферментативные и неферментативные системы, каталитически окисляющие аскорбиновую кислоту. При ферментативном окислении аскорбиновая кислота обратимо окисляется в дегидроаскорбиновую кислоту в присутствии аскорбатоксидазы, образуя еще и воду. Аскорбиновая кислота легко дегидрируется, отдавая два атома водорода. При вторичном окислении за счет веществ, возникающих при окислении полифенолов под действием о-дифенолоксидазы, возникают хиноны, которые катализируют дегидрирование аскорбиновой кислоты. Поэтому аскорбиновая кислота окисляется не только аскорбатоксидазой, содержащейся в винограде, но и в основном хинонами (табл. 5).

Таблица 5
ОКИСЛЕНИЕ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ АСКОРБАТОКСИДАЗОЙ И ХИНОНАМИ

Во всех опытах pH среды было 3,2. Фермент, осажденный ацетоном, почти не поглощает кислорода, но при добавлении к нему аскорбиновой кислоты количество поглощенного кислорода за -90 мин достигает 57,6 мкл.
Фермент + пирокатехин еще больше поглощает кислорода, так: как осажденный фермент содержит не только аскорбатоксидазу, но и о-дифенолоксидазу. При добавлении к этой системе аскорбиновой кислоты поглощение кислорода увеличивается почти в 3 раза, т. е. в этом случае аскорбиновая кислота окисляется и аскорбатоксидазой, и хинонами.
Виноградный сок поглощает за 90 мин до 45,6 мкл кислорода, но при добавлении к нему аскорбиновой кислоты количество поглощенного кислорода увеличивается во много раз. Растертый виноград еще больше поглощает кислорода, чем виноградный сок. При добавлении к нему аскорбиновой кислоты поглощение кислорода увеличивается примерно в 1,5 раза. При добавлении к этой системе пирокатехина количество поглощенного кислорода увеличивается почти в 3 раза, т. е. и в этом случае аскорбиновая кислота окисляется и аскорбатоксидазой, и хинонами.
Интересно отметить, что в системе растертый виноград + пирокатехин + аскорбиновая кислота поглощение кислорода сильно возрастает. Объясняется это тем, что аскорбиновая кислота восстанавливает хиноны в полифенолы, поэтому при повторном их окислении количество поглощенного кислорода увеличивается.

Данные, приведенные в табл. 5, показывают, что очень незначительное количество аскорбиновой кислоты окисляется ферментом аскорбатоксидазой.
Таким образом, наибольшее ее количество разрушается под
действием ферментативной системы о-дифенолоксидаза +полифенол + хинон.
Помимо этой системы, существуют еще две системы: пероксидазная и цитохромоксидазная, которые также окисляют аскорбиновую кислоту.
Впервые А. Сцент-Дьердьи высказал предположение, что аскорбиновая кислота обладает окислительно-восстановительными свойствами и участвует в дыхании растений. Но это не нашло подтверждения, пока Ф. Гопкинс и Е. Морган не установили, что глютатион в присутствии редуктазы восстанавливает дегидроаскорбиновую кислоту.
Позднее Л. Мансон подтвердил, что в растениях содержится редуктаза глютатиона, которая переносит водород с глютатиона на дегидроаскорбиновую кислоту.
Исследования X. Биверса показали, что в высших растениях содержится энзим, который способен перенести электрон от НАДФ-Н2 к монодегидроаскорбиновой кислоте, но не дегидроаскорбиновой кислоте. Таким образом, аскорбиноксидаза не способна непосредственно окислить глютатион, но в присутствии редуктазы дегидроаскорбиновой кислоты происходит непрерывное окисление глютатиона, при этом количество аскорбиновой кислоты не уменьшается. Это продолжается до тех пор, пока не окислится весь глютатион.
Равновесие системы: дегидроаскорбиновая кислота глютатион далеко сдвинуто в сторону восстановления. Следовательно, скорость восстановления дегидроаскорбиновой кислоты в аскорбиновую гораздо выше, чем ее окисление.
Молочная, винная и гликолевая кислоты в присутствии их дегидрогеназ также могут восстанавливать дегидроаскорбиновую кислоту, но гораздо слабее, чем глютатион.
Дегидроаскорбиновая кислота присоединяет воду и превращается в 2,3-дикетогулоновую кислоту, которая затем распадается на щавелевую и l-треоновую кислоты.
Совсем недавно М. Вильямс, К. Саито, Ф. Лоусон [178] показали, что l-аскорбиновая кислота, меченная в положениях ипревращается в ягодах винограда в l-винную кислоту,
меченную в положенияхт. е. в гидроксильные группы, а также в щавелевую кислоту, меченную в положении как это показано в схеме превращения l-аскорбиновой кислоты.
Исследования П. Вильяма и С. Даусона, а также М. Лее и О. Даусона [130] показали, что в простетическую группу аскорбатоксидазы входит медь в двух формах — Сu+ 75% и Сu++ 25%. Общее содержание меди в этом ферменте колеблется (0,46 + + 0,06%).
При каталитическом действии фермента происходят обратимые изменения в структуре белковой части и переход Сu++ в Сu+ образование этих комплексов не снижает активности фермента.
Было показано, что атомы Сu+ находятся в той части фермента, которая участвует в образовании перекиси водорода, возникающей в результате вторичной неэнзиматической реакции. Перекись водорода ингибирует аскорбатоксидазу, при этом голубая окраска теряется.

М. Лее и С. Даусон считают, что перекись водорода ингибирует какие-то функциональные группы фермента, в результате чего происходят изменения в его белковой части во время каталитического действия. При окислительно-восстановительных реакциях у аскорбатоксидазы валентность меди обратимо меняется.
При выдержке вина, сульфитированного из расчета 30 мг/л, количество аскорбиновой кислоты в нем сохраняется до тех пор, тюка сернистая кислота присутствует в вине. После окисления сернистой кислоты в серную аскорбиновая кислота начинает дегидрироваться в дегидроаскорбиновую кислоту. При долгой выдержке вина аскорбиновая кислота окисляется полностью, однако продукты ее превращения в анаэробных условиях, такие, как, например, фурфурол, несколько улучшают его качество. Окисление при доступе кислорода способствует накоплению перекиси водорода, усиливающей окислительные процессы, ухудшающие качество вина.