Ш. ТОПАЛЭ, д-р биол. наук
Ботанический сад Молдовы
Ключевые слова: полиплоидия, перицикл, ди-, три- и тетраплоидные формы, стерильность
Key words: polyploidy, pericycle, dilploid forms, trip laid forms and tetrapioid forms, sterility
Оценку диплоидно-тетраплоидных цитохимер и миксоплоидов винограда следует проводить по плоидности образовательной ткани стебля (перицикл). Мы впервые установили: если перицикл состоит из полиплоидных клеток, то генеративные органы растения или отдельного побега (цветки и семена) также относятся к полиплоидам. Растения с полиплоидным перициклом при макроспорогенезе в семяпочках и микроспорогенезе в пыльниках образуют два вида макро- и микроспор, а соответственно и половых клеток — диплоидные (n=38) и гаплоидные (n=19) гаметы, приводящие в результате оплодотворения к формированию разногеномного потомства, состоящего из ди-, три- и тетраплоидных сеянцев. Эта особенность диплоидно- тетраплоидных цитохимер с полиплоидным перициклом позволяет широко вовлекать их в интервалентные и отдаленные скрещивания для получения новых генотипов с ценными признаками и свойствами.
При сравнительном изучении диплоидных сортов и спонтанно возникших от них тетраплоидных форм выявлено, что при полиплоидии происходит гомология количественных признаков: они усиливаются примерно в 1,5-1,6 раза, а не пропорционально числу хромосом. Исследовав потомство всех полиплоидных форм винограда, выявленных в ампелографических коллекциях и промышленных плантациях, мы в первые установили у некоторых в семенном потомстве наличие тетраплоидных сеянцев, а у других, наоборот, ди-, три- и тетраплоидных сеянцев, полученных при расщеплении
В экспериментах с полиплоидными растениями винограда в условиях культуры при свободном опылении выявлены генетический барьер или несовместимость тетраплоидных и диплоидных форм. Этот барьер по силе действия сравнительно меньше, чем барьер нескрещиваемости между представителями родов Muscadiniaи Vitis. В комбинациях скрещивания 2nχ4n его можно сравнительно легко преодолеть и получить триплоидные формы от различных комбинаций скрещивания, хотя в реципрокных скрещиваниях триплоидные сеянцы пока не получали (Топалэ, 1971).
При этом показано, что в комбинациях скрещивания наряду с триплоидными растениями образуются и диплоидные сеянцы. Лишь в отдельных комбинациях выявлено 100% триплоидных сеянцев. В большинстве комбинаций скрещивания соотношение формирования триплоидных и диплоидных сеянцев неодинаковое, что, вероятно, зависит от компонентов скрещивания, и прежде всего от материнской формы.
Наличие третьего генома в генотипе винограда определенным образом влияет на растение. Мейоз у триплоидов характеризуется образованием гетерогенетиче- скихассоциаций и частичным асинапсисом. Гомологичные хромосомы при этом формируют объединения, варьирующие от уни-, ди-, три-, тетра- до самых разных мультивалентов. В анафазах I и II, естественно, нарушается правильное распределение хромосом по споровым клеткам. В результате возникают гипер- и гипоплоидные микроспоры с числом хромосом 19±1, 2, 3... до 38. По закону вероятности из огромного числа микроспор, образующихся в пыльниках, только ничтожно малая часть (менее 0,01%) имеет нормальный набор хромосом (19), что, кстати, отчетливо видно при анализе гроздей у триплоида ХХ-29/8, у которого в одной грозди из 280-350 ягод лишь 2-3 нормально развиты, а остальные, составляющие подавляющее большинство, — партенокарпические. Следует подчеркнуть, что у большинства микроспор n> или <19, то есть геном не сбалансирован и неуравновешен в отношении числа хромосом и генного состава, поэтому микроспоры триплоидов нежизнеспособны, стерильны и мертвы. Это экспериментально подтверждено при изучении жизнеспособности пыльцы триплоидов. В 3-летних опытах прорастание нормальных пыльцевых зерен, сформировавших пыльцевые трубки или набухших на искусственных питательных средах, едва ли достигло 0,65%, тогда как более 99,35% оказались нежизнеспособными. В связи с этим вовлечение триплоидов в скрещивания с ди-, тетраплоидами и отдаленными гибридами винограда ни в качестве опылителей, ни в качестве материнских растений нецелесообразно, так как результаты таких комбинаций скрещивания заведомо будут отрицательными. Отметим еще одно, очень важное положение о плодоносящих триплоидах винограда. При цитологическом изучении сеянцев, полученных в семенном потомстве триплоидов от свободного опыления цветков, впервые в мире установили, что семенное потомство триплоидов — диплоидное, то есть оно состояло из одних диплоидных сеянцев с 38 хромосомами.
Впервые установлено, что триплоиды винограда на 99% стерильны по пыльце и яйцеклеткам, но, несмотря на этот серьезный недостаток их гаметофитов, они все же плодовиты. У вступивших в пору плодоношения триплоидов встречаются два типа цветка: обоеполый и функционально женский. В условиях insitu наблюдается большая амплитуда изменчивости — от мелких рыхлых гроздей с небольшим числом нормально развитых ягод до средних крупных и рыхлых с большим количеством нормально развитых ягод. Ягоды продолговатой овальной или округлой формы, белые, с семенами или без них. И в условиях exsitи триплоиды винограда обладают мощным ростом, средней устойчивостью к грибным болезням, повышенным содержанием хлорофилла в листьях (у триплоидов, выращиваемых на гидропонике, листья темно-зеленые с сизоватым оттенком) и другими полезными признаками, однако имеют небольшой коэффициент плодоношения, что напрямую снижает их практическую ценность.
Из современных методов изучения отдаленных гибридов вообще и винограда в частности, безусловно, важнейшая роль принадлежит цитологическому, когда при изучении относящихся к разным подродам Euvitis и Muscadinia отдаленных гибридов винограда, полученных скрещиванием Vitis viniferaL. (2n=38) с дикорастущим американским видом Vitis rotundifоliaMichx. (2n=40), абсолютно иммунным к грибковым болезням, нематодам и вредителям, включая филлоксеру,установлено, что в их соматическом наборе 39 хромосом, то есть по гаплоидному числу от обоих видов, что согласуется с данными зарубежных авторов (Patel, Olmo, 1955; Jelenkovic, Olmo, 1968, 1969; Dermen, Harmon, Weinberger, 1970; XuXia, LuJiang, 2002). Кроме того, хромосомы скрещиваемых видов структурно неидентичны, поэтому неспособны к парной конъюгации, и в результате все гибридные растения F1, как правило, почти полностью стерильны как по пыльце, так и по яйцеклеткам.
Цитологически стерильность проявляется в многочисленных нарушениях в первом и втором мейотических делениях из-за несостоявшейся в ранней профазе парной конъюгации хромосом. Вследствие этого образуется разное число би-, уни-, три-, тетра- и поливалентов. В итоге у отдаленных гибридов готовая пыльца почти в 2 раза меньше, чем у исходных видов, и состоит из однородных мелких, иногда слегка морщинистых пыльцевых зерен. Конечно, нельзя полностью исключить причины генетического характера, которые у некоторых отдаленных гибридов (например, N.C. 6-15) проявляются как аддитивный эффект хромосомной и генной причин. Несмотря на высокую стерильность гибридов F1, отдаленная гибридизация открывает большие перспективы при получении совершенно новых форм и улучшении существующих сортов как Vitis vinifera L., так и Vitis rotundifolia Michx. путем возвратных скрещиваний. По данным зарубежных исследователей (Dunstan, 1962; 1964; Dermen, 1964; Fry, 1964), в поколениях от первого и второго беккроссов (ВС1, ВС2) фертильность и плодоносность некоторых сеянцев частично восстанавливаются, а спектр изменчивости биологических свойств в целом возрастает, что существенно позволяет повысить эффективность отборов и выявить генотипы с желательными признаками.
Эффективным методом преодоления стерильности и бесплодия у межродовых и межвидовых отдаленных гибридов помимо беккросса служат также ауто- и аллополиплоидия.
Таким образом, отдаленная гибридизация создает предпосылки для проведения углубленного цитогенетического анализа, что в конечном итоге дает возможность вскрыть общие закономерности создания отдаленных гибридов, выявить особенности формообразовательных процессов в F1 и последующих поколениях (ВС1, ВС2, ВС3, ВС4, ВС5), разработать основы частной генетики винограда.
В результате обширных палинологических исследований у сортов культурных видов рода Vitis L. (V. vinifera L. и V. labrusca L), дикорастущих видов Vitis L, представителей рода Muscadinia, некоторых других родов семейства VitaceaeJuss., отдаленных гибридов Vitis vinifera L. х V. rotundifolia F1 и -700 производных от ВС1, ВС2, ВС3, ВС4, ВС5 мы выявили 6 типов стерильности пыльцы винограда в связи с причиной, ее вызывающей. Каждый тип встречается у определенной группы растений, отличающейся по генотипу. У винограда наиболее широко распространены генная и мейотическая стерильность, тогда как хромосомная, геномная и хромосомногенная ограничены небольшой группой растений. Шестой тип стерильности пыльцы, обнаруженный впервые в 2007 г. (полная хромосомногенная стерильность), ограничен всего лишь одним отдаленным гибридом — DRX-M3-2.
Впервые у частично плодовитых отдаленных гибридов F3 отмечено появление нормальных по величине и форме пыльцевых зерен (Топала, 1987), сходных с таковыми у стандартных сортов европейского винограда. Эти экспериментальные данные указывали на начало непосредственного синтеза нового генома винограда и параллельного синтезогенеза синтетических видов винограда. В 1987 г. у гибридов, вступивших в плодоношение, процесс синтезогенеза синтетических видов винограда сильно стимулировали за счет получения в условиях ex situ двух беккроссов отдаленных гибридов F3 — DRX-M3-90 и DRX-M3-232 со свежесобранной пыльцой двух сложных французских гибридов SeyveVillary(20-366 и 12-309). Так, в результате этих удачных беккроссов была создана новая популяция отдаленных гибридов в количестве свыше 200 сеянцев, которые и составили F4. Мы выдвинули первый постулат, согласно которому с созданием 3-го поколения и получением следующих поколений отдаленных гибридов в гибридном генофонде будет присутствовать вся гамма генотипов — от абсолютно бесплодных, полуплодовитых до форм с восстановленной до нормы или даже выше плодовитостью, точно такой же, как у стандартных европейских сортов. В то же время количество самоплодовитых (автофертильные) форм по мере роста числа поколений будет непрерывно расти, а число стерильных форм ощутимо уменьшаться (Топалэ, Истрати, 2005).
От ограниченного числа возвратных скрещиваний с гибридами F1 создано -80 растений F5, включая сеянцы, полученные из семян, собранных от свободного опыления цветков, преимущественно от форм с полностью восстановленной фертильностью. Некоторые гибриды этого поколения в 2003г. зацвели и, судя по нормальной величине и форме зерен пыльцы, абсолютно аналогичны пыльце стандартных обоеполых сортов винограда. В связи с этим считаем, что мейоз в материнских клетках пыльцы (МКП) протекает нормально, без нарушений, а плодоносность гибридов F5 полностью восстановилась. Эти экспериментальные данные — бесспорное доказательство завершения синтезогенеза синтетических видов винограда в природных условиях и угасания сложных биохимических реакций в ядрах МКП и ядрах материнских клеток яйцеклеток под взаимодействием внешних и внутренних факторов (Топалэ, Даду, Истрати, 2005).
Таким образом, впервые в мире достигнут синтезогенез достаточного числа синтетических видов винограда, удачно сочетающих (соединяющих) в одном генотипе геномы культурного вида Vitis vinifera L. (η = 19) и дикорастущего американского вида Vitis rotundifolia Michx. (η = 20), ценность которого заключается в абсолютном иммунитете к болезням и вредителям, включая филлоксеру. Под воздействием беккроссов, хорошо распланированных и выполненных свежесобранной пыльцой сначала в условиях insitu, а затем exsitu, во-первых, сильно активизировался синтезогенез синтетических видов, во-вторых, форсировалось выделение в цитоплазму 39-й каверзной непарной хромосомы, которая была причиной всех нарушений парной конъюгации хромосом в ранней профазе мейоза обоих гаметофитов (мужской и женский), то есть полной стерильности пыльцы и нулевой плодоносности гибридов F1, F2, трети гибридов F3 и отдельных гибридов F4.
Гибриды с нечетным или непарным числом хромосом в соматических клетках стерильны и бесплодны: их называют, по Горюнову (1960), растительными мулами по аналогии с собственно мулами, существующими на планете около 4000 лет, но не воспроизводящими себя или не дающими потомства.
Уникальный процесс синтезогенеза синтетических видов винограда и синтеза нового генома винограда включает 4 главных этапа:
предварительный синтезогенез видов и синтез нового генома винограда, выполненный американскими учеными А. Р. Wylie (1868,1871) и L. R. Detjen (1919) и начинающийся при создании отдаленных гибридов F1 между Vitis vinifera L. (2n=38) и V. rotundifolia Michx. (2n=40). Он завершается созданием DRX-сов (R. Dunstan, 1962; 1964) DRX-58-5, DRX-60-24, DRX- 55 и др., содержащих в соматических клетках диплоидное число хромосом, равное 2n=39;
непосредственный синтезогенез синтетических видов винограда и синтез нового генома, стартующего одновременно с выполнением беккроссов в условиях insitu: DRX-55 х (Aramon х V. riparia), продолжающегося беккроссами с родительскими формами, гибридами Сейв Виллара и полиплоиды ми формами. В результате создана новая популяция отечественных отдаленных гибридов (F3) из 412 уникальных форм. Сильная стимуляция процесса синтезогенеза произведена в условиях exsitu путем выполнения двух беккроссов DRX-M3-90 х S. V. 20-366 и DRX-M3-232 х S.V.12-309. Таким образом, создано поколение F4, включающее более 200 отечественных гибридов;
на основании гибридов F4 создано около 80 гибридных растений F5 при скрещиваниях специального назначения: DRX-M4-510 χ χ Moldova (28 сеянцев), DRX-M4-520 х GM- 325-58 (11), DRX-M4-520 х Crista! (28), DRX-M4-554 χ Moldova (5), DRX-M4-556 х G8 (2), DRX- Μ4-520 х DRX-M4-519 (24 сеянца) плюс некоторые сеянцы, полученные из семян, собранных от свободного опыления цветков;
в F5 в условиях exsitu произошли самые важные события из длительного цикла синтезогенеза синтетических видов и синтеза нового генома винограда: во-первых, завершился и постепенно угас процесс синтезогенеза синтетических видов винограда под воздействием внутренних и внешних факторов; во-вторых, завершился синтез нового генома винограда путем окончательного и необратимого выделения в цитоплазму непарной 39-й хромосомы, названной каверзной, о чем свидетельствует прямой подсчет хромосом в соматических клетках (n=19, 2n=38); в-третьих, в гибридах F5 установлен правильный мейоз, то есть протекание редукционного деления без нарушений в МКП и МКЯ обоих гаметофитов, если судить по величине и форме зерен пыльцы, аналогичных с зернами пыльцы двуполых сортов Vitis vinifera L, с одной стороны, и, по нормально выполненным ягодам с полноценными семенами, с другой; и, наконец, здесь достигается апогей синтезогенеза (восстановление плодородия, то есть фундаментального свойства растения — плодоносности).
Таковы этапы радикальной трансформации стерильного и бесплодного гибрида DRX-55 с 2n=39, растительного мула в синтетические виды, гармонично сочетающие в одном генотипе качество урожая, устойчивость (резистентность) к болезням и вредителям, включая филлоксеру.
В итоге необходимо подчеркнуть, что кариологические данные по более чем 1977 сортам и клонам убедительно показывают диплоидный уровень эволюции культурных видов Vitis vinifera L, Vitis labrusca L и диких видов рода Vitis L. При этом важнейшую роль сыграли искусственный и естественный отборы, генные и хромосомнные мутации и гораздо в меньшей степени — мутации всего генома. Малое количество полиплоидных форм среди многотысячного сортимента вида V. vinifera L обусловлено особенностями агротехники винограда: осенне-зимней обрезкой, когда крупноягодные почковые мутации остаются незамеченными и удаляются; его принадлежностью к древесным растениям, среди которых полиплоидные формы встречаются редко (Stebbins, 1956).
Наряду с этим результаты собственных исследований и огромный экспериментальный материал, добытый американскими учеными и селекционерами в области отдаленных скрещиваний винограда между подродами Muscadinia и Euvitis на протяжении XIX—XXI вв., заставляют многих исследователей проявлять максимальный интерес к этому направлению, потому что метод отдаленной гибридизации, несомненно, — один из самых перспективных в генетике и селекции винограда. В самом деле, по сравнению с клоновой селекцией, внутривидовой гибридизацией с отбором F1, авто- и аллополиплоидией, мутагенезом, межвидовой гибридизацией в рамках рода Vitis L, которые полностью исчерпали себя, отдаленная гибридизация, в сущности, — единственный метод с неограниченными возможностями в отношении трансформации природы культурных видов и создания принципиально новых форм, сортов, видов и гибридов с невиданными доселе признаками и биологическими свойствами.
Межродовая и межвидовая гибридизация с широким вовлечением в селекционный процесс синтетических видов, разного рода экотипов дикорастущего вида Muscadiniarotundifolia (Michx) Small, и лесного винограда V. silvestrisGmel. служит одним из основных методов освоения дикой флоры, улучшения существующих и создания новых высокопродуктивных, высококачественных и иммунных сортов винограда к грибным болезням, нематодам и вредителям, включая самого опасного — филлоксеру. Эта задача стояла перед селекционерами на протяжении XIX и XX вв.; она будет актуальной и для наступившего XXI в., когда предстоит перейти от привитой к корнесобственной культуре винограда.
