Катехины представляют собой наиболее восстановленные, а флавонолы — наиболее окисленные соединения. Взаимное превращение одной группы флавоноидов в другую происходит посредством окисления и восстановления. Катехины и лейкоантоцианы легко подвергаются окислению и восстановлению, а также способны к легкой полимеризации.
Катехины, лейкоантоцианы, флавононы и флавонолы — бесцветные вещества, флавоны и флавонолы окрашены в желтый цвет, антоцианы имеют разнообразные оттенки красного, синего и фиолетового цветов.
Химическая формула катехинов была установлена К. Фрейденбергом. Он также показал, что катехины при нагревании в водных растворах претерпевают эпимеризацию. При нагревании ему удавалось превращать (+)-галлокатехин в (—)-галлокатехин, (+)-катехин в (—)-катехин. Некоторые авторы считают, что в растениях существуют одна и две формы катехинов, а в процессе выделения эти формы подвергаются эпимеризации.
Биосинтез и метаболизм фенольных соединений.
В 50-х годах была сделана попытка установить биосинтез фенольных соединений. Было показано, что эти вещества синтезируются в растениях из углеводов через промежуточное соединение миоинозита. Но внедрения меченого С14 миоинозита в состав фенольных соединений растений не было обнаружено.
Позднее А. Л. Курсанов (1952) впервые показал, что при вакуум-инфильтрации раствора хинной кислоты в листьях чайного растения через некоторое время наблюдается образование рядовых полифенолов (катехины и галовая кислота).
С. П. Костычев (53] считал, что в растениях хинная кислота легко превращается в галловую и гидрохинон и является связывающим звеном между углеводами и фенольными соединениями.
Шикимовый путь образования фенольных соединений.
Шикимовая кислота является как бы первой ступенью при переходе от алициклических соединений к ароматическим. X. Фишеру удалось осуществить превращения хинной кислоты в шикимовую. Образование шикимовой кислоты является первым этапом на пути перехода алициклических соединений к ароматическим.
Исследования Μ. Н. Запрометова [38] также показали, что при введении в молодые побеги чайного куста меченого радиоактивного углерода в виде растворов глюкозы, фруктозы, шикимовой кислоты и ацетата натрия через 6—24 ч наблюдается удельная радиоактивность отдельных катехинов. Наилучшим предшественником является шикимовая кислота, промежуточное место занимает ацетат натрия и значительно хуже используются углеводы. Эти опыты позволили установить, что радиоактивная шикимовая кислота включается в галловые и пирокатехиновые фрагменты молекул катехинов.
Полученные данные свидетельствовали о том, что биосинтез фенольных соединений в растениях совершается в основном двумя путями — через шикимовую кислоту и через ацетат натрия в виде ацетил-КоА и малонил-КоА. Через ацетат осуществляется синтез м-полифенолов, а через шикимовую кислоту — о- и п-замещенных полифенолов.
Роль фенольных соединений в окислительно-восстановительных процессах.
Фенольные вещества играют важную роль в обмене веществ растений. Но еще недавно существовало мнение, что фенольные соединения представляют собой конечные продукты метаболизма высших растений. А между тем экспериментальные работы последних лет показали, что фенольные вещества не только синтезируются высшими растениями, но и подвергаются в них разнообразным превращениям: участвуют в дыхании, фотосинтезе; предполагают, что они играют роль в образовании иммунитета
и др.
В последнее время особое внимание уделяют специфическим окисленным полифенолам — хинонам (убихинонам). Убихиноны (витамин К), сосредоточены в митохондриях растений и являются звеньями дыхательной цепи. Они занимают промежуточное место между флавопротеинами и цитохромами.
На конечных этапах дыхательного процесса хиноны являются акцепторами водорода. Присоединяя водород, хиноны восстанавливаются и вновь окисляются о-дифенолоксидазой в хиноны. Исходя из этого, А. И. Опарин (1927 г.) считал, что полифенолы служат связующим звеном между водородом дыхательного субстрата и кислородом воздуха.
Дегидрирование фенольных соединений типа полифенол или гидрохинон, но Михаэлису, протекает в две стадии. При этом образуется промежуточный продукт с непарным числом электронов:
Методом ЭПР было показано, что при ферментативном окислении полифенолов устанавливается равновесие между полностью восстановленной (катехол) и полностью окисленной (хинон) формами.
На первом этапе окисления один электрон от катехола передается атому меди полифенолоксидазы. На втором этапе две молекулы семихинона неферментативно дисмутируют с образованием гидрохинона и хинона.
Как ферментативное действие о-дифенолоксидазы, так и аутоксидация сопровождаются поглощением кислорода и выделением углекислоты. При этом на 1 моль катехина расходуется 1 моль кислорода.
Выделение углекислоты свидетельствует о расщеплении исходных молекул катехинов.
Исследования Б. В. Вартапетяна и А. Л. Курсанова (1955) показали, что при неферментативном окислении катехина в щелочной среде в состав продуктов окисления включается как атмосферный кислород, так и кислород воды, а при ферментативном — только кислород воды. Основываясь на полученных результатах, авторы пришли к заключению, что могут существовать различные механизмы ферментативного и аутоксидабельного окисления катехинов.
Превращение фенольных соединений.
Фенольные соединения очень легко подвергаются окислению, особенно при действии энзимов. Ферментами, катализирующими окисление фенольных соединений, являются о-дифенолоксидаза и пероксидаза. Скорость окисления зависит от pH среды. При pH 2 катехины образуют димеры со светлой окраской с сохранением пирогалловых и флороглюциновых ядер.
При pH от 4 до 8 аудоксидация катехинов сопровождается образованием флобафенов с красной окраской. При pH выше 8 аутоксидация катехинов приводит к образованию соединения типа меланинов или гуминовых кислот.
А. В. Богатский, Ю. Л. Жеребин, С. Ю. Макан [11] при подщелачивании вина выделили из него меланины. Но pH вина колеблется от 2,7 до 4,5 и выше этих значений pH не бывает, поэтому они пришли к выводу, что меланины в вине не образуются.
По данным С. В. Дурмишидзе [29], в винограде также не были найдены флобафены.
Считают, что фенольные кислоты являются предшественниками дифенолов, которые затем полимеризуются в так называемые таниды [154]. В процессе созревания винограда имеет место и деградация фенольных соединений с образованием более простых фенолов.
Окислительная конденсация фенольных соединений имеет место как при ферментативных реакциях, так и при аутоксидации катехинов и других производных. Примером могут служить дубильные вещества, проантоцианидины, лигнин и др. Инициаторами конденсации фенольных соединений являются о-дифенолоксидаза и пероксидаза.
Образованные при ферментативном окислении фенольные соединения, хинонные формы или свободные радикалы в дальнейшем неферментативно взаимодействуют с неокисленными формами катехинов и образуют димеры. Последние вновь подвергаются ферментативному окислению с образованием тримеров.
При окислительной конденсации катехинов молекулярная масса увеличивается примерно в 2 раза. Исходя из этого, А. Л. Курсанов, К. М. Джемухадзе и Μ. Н. Запрометов составили схему конденсации катехинов, которая предусматривает предварительное окисление катехинов в соответствующие хиноны, так как конденсируются не сами катехины, а их хинонные формы без разрыва пиранового кольца:
Аналогичную схему дает и Е. Робертс. За последнее время были выделены продукты конденсации катехинов в виде димерных соединений.
Механизм конденсации катехинов, несомненно, более сложный, чем предполагают эти исследователи, поскольку при окислении катехинов происходит не только поглощение кислорода, но и выделение углекислоты.
К. Фрейденберг считает, что конденсация катехинов происходит и без предварительного окисления за счет размыкания пиранового ядра одной молекулы (+)-катехина и образования С3—С6, связанного со второй молекулой (+)-катехина.
Помимо конденсации и укрупнения молекул фенольных соединений существуют процессы окислительного расщепления флавоноидов. Раньше считали, что этот процесс осуществляют только микроорганизмы и в первую очередь грибы, которые способны использовать в качестве единственного источника углерода расщепление фенольных соединений. Расщепление бензольного ядра осуществляется специальными железосодержащими ферментами, так называемыми оксигеназами-кислородтрансферразами. Для этого необходимо, чтобы предварительно происходило гидроксилирование бензольного ядра и образовывались две оксигруппы.
Раньше господствовало представление о том, что высшие растения способны только синтезировать фенольные соединения. Однако давно было показано, что растения способны усваивать фенолы и его гомологи через листья и корни.
С. В. Дурмишидзе [32] с помощью меченых атомов доказал способность к расщеплению бензольного кольца фенольных соединений виноградной лозы. Он вводил в листья и корни растения меченые 1—6 С14-фенол и бензол и наблюдал образование меченых органических кислот, а также меченых аминокислот. Среди аминокислот метка фенола включается в лейцин, аланин, метионин, валин и в другие соединения нефенольной природы.
Физико-химические свойства фенольных соединений.
Фенольные вещества хорошо растворимы в спирте, эфире, ацетоне; нерастворимы в хлороформе и бензине. Исходя из этих свойств, был разработан суммарный метод выделения фенольных соединений. Из растительных объектов они извлекаются этилацетатом и осаждаются безводным хлороформом. С железом дают зеленое окрашивание, с ванилином и концентрированной соляной кислотой — красное окрашивание. Фенольные соединения осаждаются ацетатом свинца, хуже кожным порошком и желатином.
Молекулярная масса суммарного препарата дубильных веществ в начале созревания винограда колеблется от 450 до 500, а при физиологической зрелости она выше 500D. Видимо, происходит окисление катехинов с последующей конденсацией.
В. Димайр и А. Полстер (1958) разделили дубильные вещества вина с помощью сефадекса на две фракции с молекулярной массой от 5000 до 10 000D. По данным этих авторов, основная фракция дубильных веществ вина состоит из сильно полимеризированных фенольных соединений с высокой молекулярной массой. По-видимому, дубильные вещества связаны с белками.
Фенольные вещества винограда и вина.
В винограде фенольные вещества встречаются главным образом в виде катехинов и продуктов их конденсации, которые и называются дубильными веществами.
Первые исследования по изучению дубильных веществ в ягодах винограда и вине были проведены Η. М. Сисакяном, И. А. Егоровым, Б. Л. Африкяном (1948), С. В. Дурмишидзе [29], а за рубежом — К. Хеннигом, К. Керманом, П. Риберо-Гайоном (1968) и др.
Η. М. Сисакян, И. А. Егоров и Б. Л. Африкян (1948) установили существенные колебания количества фенольных соединений в различных органах виноградной лозы в процессе вегетации.
В условиях Армении в процессе созревания винограда содержание фенольных соединений постепенно нарастает и достигает максимума к началу созревания. Затем количество их в мякоти несколько уменьшается, а в семенах увеличивается, что связано с их превращением и оттоком в семена.
Η. М. Сисакян и его сотрудники также установили, что часть катехинов прочно связана с компонентами винограда, возможно с белками. Эти катехины выделяются при гидролизе щелочью. Количество щелочерастворимых катехинов увеличивается в процессе созревания винограда. Позднее это подтвердилось и было доказано, что фенольные соединения вступают в реакцию с белками за счет группы=N—СО белковой молекулы и гидроксильной группы фенольных соединений, вследствие чего молекулярная масса их увеличивается.
Пользуясь методом фракционирования ацетатом свинца и этилацетатом, а также методом распределительной хроматографии на бумаге, С. В. Дурмишидзе и Η. Н. Нуцупидзе выделили из винограда (—)-галлокатехин, (+)-галлокатехин, (+-)-катехин, (—) -эпикатехин, (+-)-эпикатехингаллат.
Η. Н. Гелашвили и К. М. Джемухадзе [19] показали, что семена и гребни содержат значительно больше катехинов. В семенах преобладают (-+)-катехин и (—)-эпикатехин; в гребнях и кожице— (+)-катехин и (—)-галлокатехин; в мякоти винограда этих катехинов значительно меньше. В более заметном количестве в ней содержатся (+)-катехин и (+) -галлокатехин, в меньшем (—)-эпикатехин и эпикатехингаллат — в следах.
По данным М. А. Бокучавы, Г. Г. Валуйко и А. М. Филиппова [12], в винограде идентифицировано пять катехинов: (—)-эпигаллокатехин, (+) -галлокатехин, (—)-катехин, (+)-катехин и (—) -эпикатехингаллат.
Исследования С. В. Дурмишидзе и А. Г. Шалашвили [31] показали, что при созревании винограда происходит превращение С14 (+)-катехина в продукты метаболизма. Эти продукты включаются в основные группы органических кислот, а также в углеводы и аминокислоты.
Таким образом, в ягодах винограда происходит окислительное расщепление (+)-катехина и через оксибензойные кислоты он участвует в биосинтетических процессах.
