Превращения в винограде - Лакказа гриба Botrytis cinerea

Поскольку явления окисления всегда бывают намного более значительными, когда виноград поражен гнилью, необходимо исследовать оксидоредуктазу, выделяемую грибом Botrytis cinerea, вызывающим гниль виноградных ягод.

Активность фермента. Лакказа характеризуется своим действием на л-дифенолы, например на гидрохинон в соответствии с реакцией

Кроме того, лакказа отличается от тирозиназы отсутствие  активности на тирозине и активностью на n-фенилендиамине, аскорбиновой кислоте и некоторых m-дифенолах. Например:

С другой стороны, лакказа обладает, как и  тирозиназа,  значительной активностью в отношении о-дифенолов и монофенолов, исключая тирозиназу (гваякол, ванилин и n-крезол).
Нужно отметить, что специфичность лакказы довольно невелика, так как она окисляет очень большое число фенольных соединений.
Экстракция фермента. Из культуры чистой расы Botrytis cinerea в жидкой среде можно извлечь значительное количество фермента.
Питательная среда состоит из 100 мл измельченной массы зрелого красного винограда и 100 мл солода, смешанных и растворенных в дистиллированной воде из расчета 20 г/л, Эти 200 мл помещают в литровые бутыли, на дне которых находится стекловата, служащая инертной поддержкой для развития гриба. После стерилизации в течение 10 мин при 120°С, обеспечивающей разрушение ферментов винограда (в частности, тирозиназы) и обсеменение, культуры выдерживают при 20°С в течение 15 дней.
Лакказа, растворенная в жидкой питательной среде, извлекается легко, Прежде всего отделяют эту среду от стекловаты и мицелия Botrytis cinerea. Затем среду центрифугируют в течение 10 мин при 12000 об/мин для удаления взвешенных твердых частей (обрывки клеток винограда, стекловолокна и белков, осажденных во время стерилизации). Экстракцию проводят по схе-ме 2.
Приготовленный таким образом экстракт стабилен и может сохраняться в течение нескольких недель при 4°С.

Измерение  активности    фермента.

Поскольку авторы не располагали специфическим субстратом лакказы, при действии которой хинон был бы достаточно окрашен и стабилен, все измерения активности проводили описанным выше полярографическим методом, применяя, как правило, в качестве фенольного субстрата гидрохинон при рН4,75. 
Различные формы фермента. Классический способ электрофореза на акриламидном геле, используемый для определения тирозиназы, был видоизменен так, чтобы можно было работать при кислом рН во избежание потери активности фермента при рН более 7. Приготовляя гель при рН 5,25 (Дюберне, 1974), производя миграцию в течение 2 ч под напряжением 80 В и используя раствор n-фенилендиамина в буфере при рН 4,75 в качестве индикатора, получают две зоны независимо от того, какие были использованы расы, относительная интенсивность которых может изменяться.
Применение электрофореза на ацетате целлюлозы при различных рН позволяет определить изоэлектрическую точку, которая близка к 2,55. Такое исключительно низкое значение было подтверждено и при работе способом электрофокусирования, после того как экстракт был очищен пропусканием его через ионообменные смолы и обессоливанием путем диализа против холодной воды в течение 4 ч (рис. 2.6).

Схема  2

Рос. 2.6. Электрофокусирование (а) и электрофорез (б) лакказы  (Дюберне, 1974): 1 — активность лакказы; 2 — значения рН.

Специфичность фермента. В табл. 2.2 приведены значения активностей, полученных на различных фенольных субстратах при концентрации 10 мМ„ температуре 25°С и рН 4,75, с исходной концентрацией кислорода 8,1 мг/л.

Помимо того факта, что лакказа Botrytis cinerea вступает во взаимодействие с намного большим числом фенольных соединений, чем тирозиназа, и, следовательно, она менее специфична, можно констатировать следующее:
1) о-дифенолы, даже замещенные в. положении 3, окисляются;
2) n-дифенолы и m-дифенолы окисляются и эта активность характеризует лакказу из Botrytis cinerea;
3) n-фениленднамин и его производные, так же как и аскорбиновая кислота, окисляются;

Таблица 2.2
Активность лакказы на различных фенольных соединениях (Дюберне, 1974)

4) монофенолы окисляются, за исключением оксибензойной кислоты;
5) фенольные вещества вина, антоцианы и танины сильно окисляются лакказой, тогда как тирозиназа практически не окисляет их. Такое прямое ферментативное окисление антоцианов лакказой Botrytis cinerea является основной причиной окендазного касса вин. Понятно, что знание этих фактов очень важно для понимания механизма окисления сусел и вин, а также возникновения окендазного касса.
Ингибиторы. Исследование ингибиторов с общепризнанным действием на лакказы или тирозиназы проводилось на лакказе Botrytis cinerea. При этом установлено следующее:  1)   диэтилдитпокарбамат    натрия, n-политнокарбамид,  п-ннтранилин  и n-нитрофенол не оказывают действия;
2) диокси-2,3-нафтален и диметил-4,5-о-фенилендиамин оказались субстратами лакказы Botrytis cinerea;
3) цианид калия и этилендиаминчетырехуксусная кислота проявляют активность только в очень значительных дозах. Чтобы получить ингибирование около 50%, нужно обеспечить концентрацию З-10-3М.
Таким образом, лакказа Botrytis cinerea оказывается очень устойчивой к классическим ингибиторам.