Прорастание in vitro
Жизнеспособность и фертильность пыльцы винограда можно определить проращиванием (выгонкой пыльцевых трубок) в питательном растворе. Пыльцевая трубка обнаружена Amici в начале XIX столетия (1824, 1830), исследования же по проращиванию пыльцы винограда были начаты в конце XIX столетия (Rathау, 1888, 1889).
Пыльца винограда прорастает только в растворе определенного состава. Важность показателя pH раствора подтверждается многочисленными исследованиями (Ziegler, Branscheidt, 1927; Branscheidt, 1929).
По этим исследованиям пыльца винограда прорастает в растворе с pH 4,0—7,2, но наиболее высокий процент всхожести и наибольшая длина трубок по сортам получаются при pH 5,0—7,2. Важнейшей составной частью раствора является сахар. В опытах до сих пор использовали сахарозу и глюкозу в концентрации 2,5—20%. Лучшим оказался 10—15 %-ный раствор глюкозы (Rаthау, 1888; Branscheidt, 1929; Мержаниан, 1951; Коzmа, 1963, и др.). В растворе сахарозы часто наблюдается аномальный, пузырчатый, разветвляющийся рост пыльцевой трубки (Коzmа, 1951, 1951а). На прорастание пыльцы и рост пыльцевых трубок благоприятное действие может оказать прибавление к раствору сахарозы 1,5—2,0% агар-агара и 0,01—0,005% бора (Gаrtеl, 1956; Pospisilova, 1963). Концентрация бора выше 0,01 % препятствует прорастанию пыльцы, а на рост пыльцевой трубки бор влияет в концентрации минимум 0,0003%. Оптимальная концентрация по сортам различна. Лимонная кислота, соли Са и К на пыльцу винограда оказывают токсическое действие даже у минимальных концентрациях (Branscheidt, 1929). Наблюдения (Портянко, Дулова, 1969), наоборот, подтверждают, что содержание в питательном растворе Cl, КС1, Вr, КВr, J, KJ и нафтилуксусной кислоты в концентрации 0,0001 % значительно повысило процент всхожести пыльцы и среднюю длину пыльцевых трубок некоторых сортов винограда (Пассатутти, Плавай, Рислинг рейнский, Ркацители). Действие же гиббереллина в большинстве случаев было отрицательным.
Пыльца, как уже упомянуто, богата крахмалом. Начинает она прорастать только после превращения определенного количества крахмала. Поэтому добавленная к питательному раствору диастаза оказывает благоприятное влияние. Прорастание пыльцы стимулируется и рыльцем, положенным в раствор так, чтобы поверхность среза была вне раствора (Branscheidt, 1929). Пыльцевые трубки растут в направлении рыльца (гемотропизм).
Пыльца винограда одинаково хорошо прорастает и развивает трубки в пробирке или склянке.
Для опытного проращивания пыльцы винограда с различными целями весьма подходящим является разработанный Daniel (1952) количественный тест пыльцы (Коzmа, 1963).
Сахар может играть роль в питании пыльцы. На это указывает и то, что в пыльцевых трубках при содержании их в концентрированном растворе сахара можно обнаружить и вторичное образование крахмала. Бор может играть роль в транспорте сахара (Yasi1, 1964), в мобилизации пластических веществ и повышении активности аденозинтрифосфата (Daniel, Varoezy, 1957).
На прорастание пыльцы влияет и температура среды. До 11°С пыльца не прорастает, в пределах 11—15°С прорастание медленное, недружное, температура выше 35°С препятствует прорастанию. Оптимальной является температура 25—30°С. Пыльца, выдержанная в течение суток при температуре ниже 15°С, сохраняет способность к прорастанию (Sаrtоrius, 1926; Мержаниан, 1951; Koblet, 1966). Чем благоприятнее температура среды, тем скорее пыльцевая трубка достигает окончательной длины и тем длиннее она будет. При температуре около 25 °С длина пыльцевой трубки винограда в течение 3—4 h может достигнуть 300—600 μ, а через 8—10 h — 2500—3000 μ. При прорастании пыльцы процент всхожести и средняя длина пыльцевых трубок изменяются по годам в зависимости от силы кустов и условий погоды. Процент всхожести может достигать 10—-80 и более. Длина пыльцевых трубок в среднем 400—800 μ, но может достигнуть 3000 μ.
И в опытах по проращиванию пыльцы in vitro можно наблюдать различные взаимодействия. Branscheidt (1929), например, наблюдал, что при проращивании пыльцы яблони Сорта Ренет кассельский и лилии вместе с пыльцой различных сортов винограда, пыльца европейских сортов Рислинг рейнский, Мюллер Тургау оказалась менее всхожей, чем пыльца американских видов (V. arizonica, V. riparia).
На поверхности пыльцевого зерна винограда имеются три поры, из них только одна развивает пыльцевую трубку, но иногда наблюдается появление и 2—3 коротких трубок. Пыльцевая трубка вырастает через пору из интины. На поре пыльцевого зерна в питательном растворе через 5—10 min появляется шариковидное образование, затем начинается рост пыльцевой трубки. Генеративная клетка проникает уже в начале роста в короткую трубку, делится на два спермия, которые передвигаются к концу трубки. Можно регистрировать и движение вегетативной клетки.
Всасывающая сила пыльцы в начале прорастания доходит до 45 atm. В пыльцевой трубке в фазе роста эта сила несколько ниже. Пыльцевая трубка большей частью состоит из целлюлозы, главной составной частью верхушки ее служит пектин, а η-инозит включается в оболочку трубки в качестве пропектина. Оболочка пыльцевой трубки имеет первичное строение, структура ее верхушки рыхлая, задняя часть трубки затвердевает после формирования новых целлюлозных волокон. Зона поверхностного роста ограничивается 4— 7 μ за верхушкой, мембрана удлиняется, волокна не перестраиваются (Linskеns, 1967). В плазме пыльцевой трубки присутствуют протопласт, ограниченный мембраной, связанной эндоплазматическим ретикулумом, многочисленные митохондрии, пластиды, липоидные вакуоли, дихтиосомы и несколько везикул Гольджи, главным образом в конце трубки.
Прорастание in vivo
Пыльцевое зерно, попадая на рыльце, в секрете его развивает трубку, которая растет не в канале, а во внутренних трех слоях проводящей ткани столбика таким образом, что над фуникулусом проникает в гнездо завязи, а оттуда растет до фуникулуса и через микропиле проникает в зародышевый мешок.
Для роста трубки пыльца использует значительное количество своих пластических веществ, но растущая пыльцевая трубка поглощает и вещества рыльца. Между пыльцой и женским гаметофитом происходит интенсивный обмен веществ. В ходе роста пыльцевые трубки используют более 40% проводящих тканей колленхимного происхождения столбика. Это подтверждается и данными о дыхании. Пыльцевые трубки способны превратить углекислый газ в протеиновые фракции. Энергия, необходимая для восстановительных процессов и усвоения, происходит из окисления углеводов, полученных частично из пыльцы и частично из завязи (тканей столбика) (Linskens, 1967).
Проникновение пыльцевой трубки в ткани рыльца регулируется ее гидротропизмом и гистохимическими и физико-химическими условиями (электрический потенциал рыльца и завязи неодинаков). Пыльцевые трубки направляются к катодам. Аминокислоты, соли и сахари в определенном составе также способны повысить гемотропное раздражение.
Фертильность пыльцы определяется ее жизненностью и функциональной способностью.
Пыльца функционально женских цветков, попадая на рыльце, в секрете его не может развить трубку, но набухает, принимает шариковидную форму и путем диффузии выпускает в пестик стимулирующие вещества, которые могут служить началом образования бесcемянных ягод.
Количество стерильных зерен в пыльце функционально женских и обоеполых цветков может быть различным в зависимости от условий питания и неблагоприятных условий погоды в процессе морфогенеза. Такие пыльцевые зерна неспособны развивать трубку или же развивают лишь короткую трубку, и функция их подобна функции пыльцы функционально женских цветков.
На оплодотворяющую способность пыльцы влияют и условия питания куста. Некоторые исследователи (Sаrtоrius, 1926) пришли к заключению, что для окончательного развития соцветия в период от распускания почек до цветения требуется мало питательных веществ. Опыты Winkler (1926), а затем Kozma (1957а) подтверждают, что с увеличением нагрузки куста растут процент прорастания пыльцы и средняя длина пыльцевых трубок, но в связи с этим снижаются степень развития и способность к оплодотворению пестика и завязи. Снабжение питательными веществами и способность к оплодотворению цветков можно улучшить некоторыми зелеными операциями (кольцеванием побегов, прищипкой плодоносных побегов). Внесение удобрений, по данным Wanner (1934), влияет положительно на функциональную способность пыльцы. Из питательных веществ особенно недостаток фосфора снижает фертильность пыльцы, недостаток же в азоте и калии не оказывает ощутимо отрицательного влияния.
Процент прорастания, рост трубки и фертильность одной и той же пыльцы определяются половой совместимостью по видам и сортам (Вrаnsсhеidt, 1929; Димитров, 1948; Жученко, Семин, 1965, и др.). Особенно показательными с точки зрения физиологии оплодотворения винограда оказались опыты Жученко и Семина (1965). Кастрированные и некастрированные цветки сорта Коарнэ нягрэ, обработанного радиоактивным изотопом фосфора, были опылены пыльцой сортов Фетяска и Карабурну. Через 2, 8, 24, 48, 72 h после опыления авторы определили число импульсов за 100 s в завязах. Транслокация фосфоров в направлении цветков, оплодотворенных пыльцой сорта Фетяска, была намного интенсивнее (в 1,5— 2 раза), чем к цветкам, оплодотворенным пыльцой Карабурну. Кастрация также снизила интенсивность притока фосфора. Из радиоактивных частиц γ-лучи до 1000—5000 Rӧ благоприятно влияют на фертильность пыльцы (Жученко, 1964).
Условия хранения пыльцы
В селекции винограда часто приходится прибегать к хранению пыльцы. Пыльца винограда сохраняет свою фертильность в естественных условиях в течение 4-6 дней. При хранении на часовом стекле в условиях комнатной температуры в продолжение 10—20 дней пыльца еще развивает трубку. При хранении в эксикаторе над хлористым кальцием в условиях комнатной температуры пыльца сохраняет свою фертильность до 2—3 месяцев. Экспериментально подтверждено, что при температуре 1°С и 40—50% относительной влажности воздуха пыльцу винограда можно сохранить в жизнеспособном состоянии в течение года, а при температуре — 12°С и 28—54% относительной влажности воздуха можно сохранить фертильность до 4 лет (Маnаrеsi, 1957; О1mо, 1942; Kozma, 1963а).
Фертильность пыльцы винограда особенно снижают высокая относительная влажность воздуха, высокая температура и интенсивное освещение.
В нормальных физиологических условиях первопричинами снижения всхожести и фертильности пыльцы являются расходование субстрата дыхания, энзимов и ростовых веществ и действие ультрафиолетовых лучей солнечного света. Для пыльцы винограда могут быть вредны также бактерии и вирусы.
