Е. К. Планида
ДЫХАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
Дыхание как сложная и многообразная окислительно-восстановительная система, объединяющая специфические процессы в комплексе обмена веществ, присуще всем живым организмам, в том числе и растительным. В связи с этим механизм жизнедеятельности растений сопровождается наряду с другими физиологическими и биохимическими процессами и весьма сложными процессами дыхания.
На основе новейших достижений биохимии и физиологии растений дыхание представляется как комплекс разнообразных превращений органических веществ, где вместе с процессами окисления до углекислоты протекают процессы синтеза, также необходимые для нормальной жизнедеятельности растений (Рубин, 1967).
В растении предельно четко и направленно осуществляется взаимосвязь и сопряженность различных типов обмена веществ, в основе которых, наряду с другими специфическими превращениями, лежит присоединение кислорода и отнятие водорода с образованием конечных продуктов окисления или восстановления и промежуточных соединений, вовлекаемых в дальнейшие беспрерывно повторяющиеся процессы биосинтезов. Эти процессы требуют активирования исходных продуктов с затратой энергии дыхания. Использование энергии дыхания осуществляется при участии соответствующих ферментных систем. В связи с этим активность окислительно-восстановительных ферментов часто рассматривается как косвенный показатель процессов дыхания.
В процессе окисления принимают непосредственное участие и витамины как коферменты энзимов, дегидрирующих субстраты дыхания.
Энергия, выделяемая в процессах дыхания, необходима не только для биосинтезов. Ряд процессов, осуществляющихся в клетках растения, требует затрат энергии. К ним относятся деление клеток, поглощение минеральных веществ корнями, поступление питательных веществ в различные органы растения в отдельные периоды вегетации, передвижение пластических веществ в проводящих тканях, поддержание биофизической структуры протопластов, движение растений и др. Энергия дыхания необходима для обеспечения нормального прохождения различных функций каждого растительного организма, вследствие чего этот процесс тесно увязан со всеми видами обмена веществ. Для осуществления их, кроме субстратов дыхания, вовлекаются многие другие соединения, в том числе промежуточные, образующиеся в том или ином цикле превращений с помощью ферментов, пигментов и др.
На взаимосвязь и взаимообусловленность обмена белков, углеводов, жиров, органических кислот, алкалоидов, витаминов, минеральных веществ и других соединений указывают Сисакян (1954) и многие другие.
В процессах окисления основными веществами или субстратами дыхания являются углеводы. Превращение углеводов в живом организме по пути гликолитического распада до образования пировнноградной кислоты (анаэробная стадия) и последующее превращение через цикл Кребса (аэробная стадия) представляет, с некоторыми отклонениями, основной путь дыхания у всех высших растений, в том числе и у винограда.
Вторая стадия процессов гликолитического распада — цикл Кребса или цикл дитрикарбоновых кислот протекает в растительных клетках с участием многих органических кислот. Органические кислоты широко распространены в растительных организмах и имеют большое значение в обмене веществ. В различных органах растений чаще всего имеются яблочная и щавелевая кислоты, реже янтарная, фумаровая, уксусная, гликолевая, глиоксилевая и др. Винная кислота обнаружена далеко не у всех растений. К немногочисленным видам, представители которых характеризуются присутствием в тканях их органов винной кислоты, относится V. vinifera. Большинство перечисленных кислот, как отмечалось выше, входит в состав органов винограда, принимающих участие в обмене веществ, что ярко отражено в их количественном и качественном изменении в течение вегетации, и, особенно, в ягодах в период их созревания.
За последние годы многие исследователи показали, что окисление пировиноградной кислоты зависит от совместного окисления ди- и трикарбоксильных кислот — яблочной, янтарной, фумаровой и др. Трикарбоксильному циклу в дыхании растений и у винограда отводится исключительная роль. Органические кислоты участвуют в важнейших процессах обмена веществ в растительной клетке, и пировиноградная кислота может быть метаболитом при окислении углеводов в листьях (М и х л и и, Б а х, 1938; Barron, 1950; Ochoa, 1951; Krebs, 1952 и др.).
Пировиноградная кислота вступает в цикл трикарбоксильных кислот, при этом происходит отщепление трех молекул угольной кислоты и пяти пар водородных атомов, передаваемых цитохромоксидазной системой кислороду для окисления. Авторы полагают, что подобные окисления могут осуществляться и с многими другими соединениями и промежуточными продуктами. Биохимические процессы, протекающие в растительных клетках, связываются между собой различными промежуточными каталитическими процессами. Так, существует теснейшая связь превращения органических кислот с метаболизмом азотистых веществ, и дыхание при этом оказывается центральным связывающим звеном.
Таусон (1950) считает, что превращение отдельных органических кислот дает основу для образования различных других продуктов, объединяя при этом углеводный и белковый обмен в единое целое при участии аминокислот и соответствующих кетокислот путем аминирования и дезаминирования, как об этом пишут Браунштейн (1949), Кретович и Бундель (1948).
В винограде найдены дегидрогеназы цикла трикарбоксильных кислот, маликоэнзим, а также карбоксилаза пировиноградной кислоты. Установлено закономерное увеличение лимонной кислоты в процессе созревания винограда.
Увеличение поглощения кислорода обнаруживается после погружения ломтиков ягод винограда в растворы солей янтарной, яблочной и лимонной кислот (Родопуло, 1960). Этот же автор намечает пути превращения органических кислот винограда в процессе его созревания.
Яблочная кислота окисляется маликодегидрогеназой в присутствии ДПН до щавелевоуксусной кислоты, которая в дальнейшем декарбоксилнруется в пировиноградную, а последняя, возможно полимеризуясь, превращается в углеводы.
Для винной кислоты (ферментная система ее окисления не найдена) автор предполагает путь окисления в диоксималеиновую кислоту ферментной системой, содержащей в своей молекуле железо. Диоксималеиновая кислота окисляется оксидазой диоксималеиновой кислоты в дикетоянтарную. Последняя, декарбоксилируясь и окисляясь, превращается в гликолевый альдегид и в глиоксилевую кислоту, которая окисляется в щавелевую кислоту. В процессе созревания гликолевый альдегид легко может превращаться в углеводы. В литературе известно (Кузин, 1938), что гликолевый альдегид может полимеризоваться в углеводы. Подтверждением возможности такого превращения органических кислот в углеводы является наличие в незрелых ягодах винограда перечисленных промежуточных соединений.
А. К. Родопуло обнаружил в винограде также сукциндегидрогеназу, которая переносит водород на кислород, активируемый окислительными ферментами.
Уменьшение кислотности в процессе созревания винограда с одновременным непрерывным увеличением содержания углеводов, присутствие промежуточных соединений в ягодах и соответствующих ферментов и дегидрогеназ позволяет решать вопрос о превращении органических кислот и углеводов в ягодах винограда с точки зрения дыхания по циклу трикарбоксильных кислот.
Amerine и Peynaud (1965) объясняют уменьшение кислот в течение созревания ягод процессами дыхания. Данных по этому вопросу не так уж много. Еще с 1897 г. известны результаты исследований Gerber, в которых он указывает на то, что кислоты принимают участие в обмене веществ в ягодах при дыхании. Различные предположения о том, что кислоты могут переходить в сахара и сахара в кислоты, высказаны в работах Wolf (1959). В последние годы интересные исследования в этом направлении проводили Dаwert и Steffan (1965). Опыты проведены ими с использованием соединений винной кислоты, глюкозы, глютаминовой кислоты и ацетата, меченых 14С. Объекты опыта (побег с гроздью и отделенная от побега гроздь) находились в темноте после введения меченых соединений в течение 64 часов при температуре 26—28 °С. Исследования проводились с 4/IX по 26/IX — в период созревания.
Результаты проведенных опытов показали, что винная кислота, введенная в плодоносящий побег, обнаруживается в большем количестве в листьях, побегах, черешках, гребне грозди и в меньшем — в экстракте из ягод. Глюкоза движется предпочтительно в ягоды. То же самое установлено и для грозди, отделенной от побега. Обогащение винной кислотой перечисленных частей побега и гребня грозди позволяет авторам сделать вывод, что эти части винограда исполняют функцию "склада" винной кислоты. Этот результат находится в соответствии с данными Peynaud и Maurie (1953), согласно которым содержание кислот значительно уменьшается только в ягодах, а в кожице и гребне грозди, напротив, увеличивается.
Рис. 1. Скорость дыхания меченых соединений (среднее из 4 определений по Драверту)
1— винная кислота; 2 — глюкоза; 3 — глютаминовая кислота; 4 — ацетат
Далее авторы отмечают, что глюкоза ягод, отделенная от побега грозди, расходуется на дыхание лишь наполовину по сравнению с гроздью на побеге. Винная кислота, наоборот, у отделенной грозди включается в дыхание в большей степени, чем у грозди на побеге.
Винная кислота в соответствии с экспериментальными условиями в большей мере, чем глюкоза, является дыхательным субстратом ягод.
Меченные 14С глютаминовая кислота и ацетат в соответствии с их ролью метаболитов расходуются на дыхание сравнительно сильно. Активность глютаминовой кислоты составляет 30% активности экстракта ягод. Разделение активности по фракциям экстракта — аминокислоты, органические кислоты и нейтральные вещества показало наличие ее во всех трех фракциях.
Кривые расхода на дыхание показали (рис. 1), что у побега с гроздью винная кислота расходуется на дыхание медленно и непрерывно по типу линейной функции, повышающейся во времени, что может быть связано и с наличием ее запасов.
Основная часть глюкозы дышит с выделением СO2 уже через 10 часов после ее введения, что можно объяснить быстротой ее транслокации. Также быстро расходуется на дыхание часть глютаминовой кислоты и ацетата.
На основании полученных величин дыхания авторы смогли выявить отправные точки для биологического времени, в течение которого превращается половина меченых соединений, взятых для эксперимента. Эта точка для ацетата и глютаминовой кислоты в опытах с плодоносящим побегом и отделенной гроздью составляет 52—53 часа, для глюкозы и винной кислоты в опыте с плодовым побегом 100—140 часов. В отделенных гроздях, наоборот, биологическая половина ценного времени составляет 250 часов для глюкозы и 100 часов для винной кислоты. Полученные результаты подтверждают способность ягод грозди к самостоятельному обмену.
Таким образом, все введенные меченые 14C соединения в большей или меньшей степени расходуются на дыхание и участвуют посредством него в увеличении содержания сахаров по мере созревания ягод.
Хранение винограда, подбойного и привойного материалов в зимнее время, изучение морозоустойчивости и др. требуют ясности и понимания протекающих процессов дыхания тканей с целью лучшего сохранения материала для прививок и ягод с наименьшей затратой запасных веществ.
В связи с этим представляют определенный интерес работы Роugеt (1963). Изучение изменения газообмена проведено им на черенках с почками сорта Мерло на приборе Вартбурга. Длина черенков 2 cm с диаметром 7—8 mm. Определение адсорбции O2 проведено в аэробных и анаэробных условиях в атмосфере азота при температуре 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50°С. Кроме этих исследований, автором проведены наблюдения поглощения кислорода черенками с почками длиной в 35 cm. Он доказал, что так же, как и поглощение кислорода, выделение СO2 в анаэробных условиях является линейной функцией времени и температуры. Значение гликолиза автор сопоставил с потерей запасных веществ тканями растения. Теоретический расчет показывает, что для получения 1 ml СO2 в аэробных условиях затрачивается 1,339 mg, а в анаэробных — 4,017 mg глюкозы. Кроме того, гликолиз, протекающий в анаэробных условиях, имеет большее значение, чем в обычных, так как он значительно (в 3—4 раза) повышается при температуре, равной или превышающей 20 °С. Для его прохождения длина черенков не имеет такого значения, как при аэробных условиях. При 20°С поглощение кислорода по общему весу вчетверо слабее для черенков длиной в 35 cm, чем при длине 2 cm. Это объясняется трудностями диффузии кислорода в ткани длинных черенков. Расход глюкозы у длинных черенков в аэробных условиях значительно меньше, чем у коротких. Полученные данные позволили автору физиологически объяснить наблюдения, относящиеся к метаболизму (гликолизу) в период покоя и предложить указания по хранению черенков в зимний период. Чтобы уменьшить потери запасных веществ при хранении, необходимо снизить интенсивность дыхания и хранить черенки длинные, а не короткие, в помещении для хранения поддерживать атмосферу, по составу близкую к воздуху, чтобы избежать усиления процесса гликолиза. Температура в хранилище должна быть ниже 10 °С. Температурные условия имеют особое значение также при хранении винограда в свежем виде с учетом возможных сочетаний аэробного и анаэробного дыхания.
Как отмечалось выше, Pouget наблюдал эффект Пастера в исследованиях метаболизма дыхания почек винограда, обработанных риндитом. Мflier и др. (1936) (по Pouget, 1963) отмечали, что после применения дихлорэтилена клубни картофеля показали интенсивное выделение СO2, что авторы объяснили активацией интенсивности дыхания, не освещая механизма этого явления.
Окислительные превращения молекулы гексозы по схеме гликолитического окисления с участием дифосфорного эфира гексозы не являются единственными в процессе дыхания. Существует второй путь, в основе которого лежат окислительные превращения монофосфорного эфира гексозы (Рубин, 1967) по циклу аэробных превращений, аналогичных реакциям гликолиза. Полученный на этом этапе окисления глюкозо-6-фосфат окисляется в 6-фосфоглюконат, подвергающийся окислительному декарбоксилированию с образованием при этом пентозы и выделением молекулы СO2. В виноградном растении имеются пентозные соединения, свидетельствующие о наличии пентозофосфатного распада глюкозы в дыхании тканей и этого растения.
В живом организме процессы окисления начинаются с отнятия водорода и переноса его на кислород воздуха. Этот процесс требует активирования кислорода воздуха и водорода дыхательного субстрата. Активирование осуществляется при участии ферментных систем.
Растения, в том числе виноград, осуществляют развитие всех органов и работу специфических их тканей при непрерывной смене условий температуры, освещения, влажности, а также нормальное прохождение морфогенеза в онтогенезе отдельных органов благодаря наличию не одной, а нескольких дыхательных и ферментных систем, обеспечивающих разные этапы окисления. У винограда ферментная система представлена всеми видами оксидаз, свойственных растениям и обнаруженных в тканях различных органов, количество и активность которых изменяются в зависимости от условий среды, возраста самого растения и отдельных его органов, этапов морфогенеза в процессе онтогенеза.
Такие оксидазы, как пероксидаза, полифенолоксидаза, аскорбиноксидаза, а также каталаза обнаружены во всех органах виноградного куста — листьях, ягодах, побегах зеленых и одревесневших, корнях, почках, завязях, пыльце и в пасоке весной. Во всех этих объектах обнаружена цитохромоксидаза, за исключением зрелых ягод винограда. Ее отсутствие в ягодах иллюстрировано в работах А. К. Родопуло (1960).
Дегидрогеназы обнаружены в листьях, побегах и ягодах винограда. В частности, в ягодах винограда имеются дегидрогеназы яблочной и диоксималеиновой кислот (Родопуло, 1960). Аспарагиновая и никотиновая кислоты обнаружены в ягодах, листьях, побегах и гребнях винограда. В ягодах винограда найдены суксиндегидрогеназа, маликодегидрогеназа (Родопуло, 1960). Неизменный спутник окислительно-восстановительных процессов — фосфорилаза также имеется в органах виноградного куста, как и такие участники, как амилаза, инвертаза и многие другие.
В обмене веществ растительных организмов принимают участие также дубильные вещества (Опарин, 1932; Курсанов, 1947). Они служат катализаторами как переносчики водорода. Их относят к ряду хромогенов (Палладии, 1960) и хлорогеновой кислоты (Опарин, 1921), играющих важную биологическую роль.
Дубильные вещества (Курсанов, 1941) являются сложной смесью циклических соединений, начиная с простейших свободных полифенолов и катеинов и танинов и кончая высокомолекулярными конденсированными соединениями.
Дубильные вещества придают устойчивость растениям (Б а х, 1950; Рубин, 1951) к заболеваниям, что подчеркивает их физиологическую роль в жизнедеятельности организмов.
По теории академика Опарина (1936) дубильные вещества (полифенолы, танин, флавоны и др.), содержащие фенольные группировки, способны окисляться в присутствии полифенолоксидазы и образовывать хиноны, которые способны дегидрировать легкоокисляемые вещества, например, аскорбиновую кислоту и др.
В результате исследований окислительных ферментов винограда и виноградного сусла (Родопуло, 1954) автор установил, что в винограде и сусле содержатся полифенолоксидазная и пероксидазная окислительные системы, причем полифенолоксидазная система играет главную роль в окислении дубильных веществ с образованием темноокрашенных продуктов — хиноноподобных веществ. Пероксидазная окислительная система действует на дубильные вещества после появления перекиси водорода с образованием соломенно- желтых продуктов. Полифенолоксидаза в винограде и сусле находится в растворенном и нерастворенном состоянии, нерастворимый фермент активнее.
Аскорбиновая кислота винограда и сусла окисляется аскорбиноксидазной системой и хинонами. Автором установлено, что дубильные вещества сусла винограда играют роль переносчиков водорода в полифенолоксидазной системе в присутствии аскорбиновой кислоты с восстановлением хинонов, т. е. дубильные вещества виноградного сусла играют роль хромогенов и хлорогеновой кислоты.
Таким образом дубильные вещества являются активным участником окислительно-восстановительных процессов у винограда, выполняющим важнейшие физиологические функции.
