Для исследования коллоидных явлений в вине нужно задерживать и разделять не крупные частицы, вызывающие помутнение, а частицы коллоидные, намного более мелкие, которые обычно находятся в прозрачном растворе. Ультрафильтрацию, которая в большой мере обеспечивает достижение этой цели, обычно проводили на коллодиевых мембранах, приготовляемых с выпариванием коллодия, т. е. раствора нитроцеллюлозы в смеси спирта с эфиром. Такие мембраны имеют очень мелкие поры, и их размеры зависят от концентрации нитроцеллюлозы и условий испарения.
При фильтрации на коллодии, которая всегда дает совершенно прозрачные вина, адсорбируются некоторые компоненты, в том числе белки. Здесь также необходимо удалять первое профильтрованное вино и не смешивать эффект адсорбции с задержанием частиц порами меньшего диаметра. Можно использовать как коллоидные мешки, которые приготовляют в лаборатории, так и мембраны, находящиеся в продаже. Последние хорошо сохраняются в обычной воде с добавлением 200—300 мг/л сернистой кислоты.
В качестве примера использования коллоидных мешков можно привести разделение камедей и растительных слизей. Это разделение может быть осуществлено дробным (фракционным) осаждением при добавлении в сусло или вино всевозрастающих количеств спирта. Слизи (особенно декстран) осаждаются в виде филаментарных волокон, когда содержание спирта в жидкости составляет около 20%. Камеди выпадают в виде гранулированных хлопьев, когда содержание спирта достигает 50С процесс осаждения декстрана спиртом в водном растворе протекает в следующем порядке. При вливании спирта с легким перемешиванием происходит образование настоящего желе (студня). Жидкость становится очень вязкой и даже затвердевает. Она с трудом вытекает при переворачивании колбы. Не видно поднимающихся пузырьков воздуха, как если бы их удерживала какая-то невидимая сетка. После нескольких перемешиваний сетка прорывается и превращается в перепутанные волокна.
В вине состояние декстрана в определенной степени зависит от действия спирта, при различной спиртуозности частицы имеют больший или меньший объем. При очень высоких дозах декстрана какие, например, бывают в суслах и винах из винограда, пораженного Botrytis, это вещество вызывает действительное затвердевание жидкости, характеризуемое трудностями для подъема пузырьков газа, эта твердость зависит от содержания спирта.
Мандро (1973, 1974) использовал мембраны Сарториуса или Миллипор с очень пористой структурой, поскольку поры в них составляют около 10% от общего объема. Эти поры одинаковы по размерам, известно более 20 размеров различных пор — от 0,025 до 14 мкм. Но проведенные исследования показывают, что происходит значительное задержание более мелких частиц из-за очень быстрого забивания мембраны. В этих условиях не представляется возможным использовать фильтрующие мембраны для измерения размеров частиц или для измерения прозрачности. Но, как было показано выше, мембраны оказались очень полезными при исследовании коллоидных явлений в винах.
Современные способы ультрафильтрации и хроматографии на геле
В настоящее время для исследования вина изготовляются мембраны для ультрафильтрации типа Миллипор или Сарториус, намного лучше выполненные и калиброванные, обеспечивающие хорошее фракционирование веществ, присутствующих в растворе, в зависимости от величины частиц, даже для очень малых молекулярных размеров. Кроме того, эти мембраны имеют большое сопротивление, допускающее, высокие давления и обеспечивающие заметное повышение производительности. Обычно они состоят из сложного эфира целлюлозы, но известны и другие типы. Некоторые мембраны состоят из двух слоев, один из которых очень малой толщины, прилегает к толстой пористой подложке, которая придает мембране необходимую устойчивость.
На некоторых мембранах фильтрация представляет собой процеживание (пористые мембраны), на других молекулярную диффузию (полупроницаемые мембраны). Магнитная мешалка, или вибропластинка на поверхности мембраны отбрасывает вещества в направлении жидкой массы и препятствует концентрации их на поверхности мембраны и, следовательно, быстрому уменьшению стекания. Каждому типу мембраны соответствует свой тип фильтрующей камеры (секции).
Глори (1971) использовал все эти методы ультрафильтрации для исследования конденсации танинов красного вина одновременно с фильтрованием на геле Сефадекс, принцип которого он подробно описал. Сефадекс представляет собой коммерческое название, которое обозначает гранулированный продукт, состоящий из мелких шариков углеводной природы (гидрофильные полисахариды, состоящие из цепей декстрана, расположенных в пространстве, с нормализованной степенью полимеризации). Помещенные в растворитель гранулы набухают в большей или меньшей степени в зависимости от качества и серии, к которой они относятся, и образуют гель.
Поверхность этого геля имеет поры, размеры которых зависят от степени набухания. Молекулы, размеры которых превосходят самые большие поры, не могут проникнуть в зерна геля; следовательно, они проходят через фильтр с жидкой фазой, циркулирующей вокруг гранул, и выходят из колонки первыми; и наоборот, более мелкие молекулы рассеиваются в большей или меньшей мере в геле соответственно их размерам и форме и проходят сквозь фильтр с запозданием. В общем, мелкие молекулы следуют после больших. Это явление можно использовать для определения их молекулярной массы с помощью подобранных эталонов.
Фильтрация на геле Сефадекс позволяет разделять с удовлетворительной точностью танины и антоцианы красных вин, т. е. получать практически чистые танины, и иметь приближенную оценку средней молекулярной массы конденсированных танинов. Ультрафильтрация на микропористых мембранах с правильно подобранной проницаемостью позволяет определять показатель полимеризации, характеризующий каждое вино; во время созревания вин отмечается увеличение конденсации. Ультрафильтрация дает возможность констатировать соединение молекул антоцианов и танинов старых вин (Глори, 1971).
Другой способ заключается в том, что каждый образец пропускают через гель, затем постепенно вводят элюат. Мелкие молекулы элюируются после крупных. Этот метод хроматографии на геле Сефадекс, или молекулярное процеживание, описали и применили на вине Бержере и сотрудники (1970), для исследования белков винограда и вина и физико-химического исследования желатина и рыбьего клея. Еще ранее хроматографию на геле применяли в своих экспериментах Вухерпфенниг и Франке (1963) и Дагуа (1969).
В последние годы Фейлат и Бержере (1972) получили очень высокую точность при использовании электрофореза на полиакриламидном геле с целью разделения, концентрации и анализа растворимых белков винограда и вина. Благодаря сочетанию предыдущего метода хроматографии на Сефадексе (декстран с поперечными решетчатыми связями) с ультрафильтрацией на мембране Миллипор они смогли получить образцы белков, достаточно концентрированных и очищенных для последующего анализа на полиакриламидном геле. Эти авторы получили совершенно новые результаты относительно качественного содержания белков в суслах и винах. В исследованных суслах и белых винах известны две группы белков: одна с молекулярной массой, равной 150 000 или больше, другая же с молекулярной массой, близкой к 50 000. Содержание этих молекул очень невелико и меньше, чем у полипептидов, молекулярная масса которых близка к 8000.
Более того, Фейлат и Бержере (1973) использовали хроматографию на ионообменных смолах для качественного анализа пептидов вина. В винах одного и того же происхождения, ранее исследованных, они нашли смесь пептидов с молекулярной массой менее 5000, фракционирование которой на ионообменниках показало большое разнообразие и выявило некоторые фракции с абсорбцией в ультрафиолетовом излучении и с положительной реакцией на орсин (в присутствии пентоз), довольно характерной для нуклеиновых оснований.
Следует также указать на некоторые последние работы по фракционированию белков. Блатт (1971) использовал распределительную хроматографию на мембране. Неренберг (1971) применил сегментную электрохроматографию: использованная сегментная колонка имеет большое число выходных отверстий, распределенных по всей ее длине, чтобы обеспечить отбор, или элюцию, специфических сегментов геля (содержащих в себе разделенные белки) после прохождения.
Месроб и сотрудники (1971) извлекали белки белых вин, не обработанных или обработанных бентонитом или желтой кровяной солью, и сравнивали состав белков в различных пробах. После хроматографии на геле Сефадекс они получили две фракции. Различные фракции разделяют также методом электрофореза. Получаемые результаты хорошо согласуются с результатами хроматографии на геле.
