Руководство по микробиологии виноделия - Микрофлора виноградных сусел

ЧАСТЬ II
МИКРОБИОЛОГИЯ ВИНОДЕЛИЯ

ГЛАВА I
МИКРОФЛОРА ВИНОГРАДНЫХ СУСЕЛ

ЗНАЧЕНИЕ МИКРОФЛОРЫ ВИНОГРАДА

Качество вина зависит от двух основных факторов: качества винограда, поступающего на переработку, и технологии виноделия. В свою очередь оба эти фактора тесно связаны с вопросами микробиологии. Под качеством винограда мы должны понимать не только механический и химический его состав, но и ту микрофлору, которая развивается на виноградной грозди на самом кусте и при доставке на винзавод.
Нельзя забывать и о том, что второй фактор, влияющий на качество вина, т. е. технология виноделия, если исключить вопросы механизации, в очень большой степени зависит от жизнедеятельности микроорганизмов — возбудителей спиртового брожения. Технологический процесс виноделия состоит главным образом в том, что винодел должен правильно и рационально использовать живое орудие производства — дрожжи.
Вкус и букет готовой продукции — вина в значительной мере будут зависеть от работы дрожжей.
При дальнейшей же выдержке вина его качество может улучшаться или, напротив, значительно ухудшаться под действием различных микробов.
Какова же микрофлора винограда, отчего она зависит, откуда берётся? Всегда ли она постоянна? Как ведёт она себя на ягодах, в сусле, при брожении и в готовом вине, а также при утилизации отходов? Какие взаимоотношения складываются между отдельными видами этой микрофлоры?
На все эти вопросы мы и должны будем ответить во II части.
Виноградные ягоды, особенно повреждённые градом, насекомыми или другим путём, являются носителями богатого и разнообразного мира микроорганизмов. В доступном для них соке на месте повреждения микроорганизмы находят изобилие питательных веществ и размножаются поэтому с огромной быстротой.
При раздавливании винограда все эти микроорганизмы попадают в сусло и продолжают своё развитие. Преобладающее большинство их видов является вредным для вина. Так, на одну клетку эллиптических (винных) дрожжей может приходиться от 100 000 до 1 000 000 клеток диких дрожжей, не считая ещё плесеней и бактерий. Следовательно, при спонтанном (произвольном) брожении сусла не может быть обеспечено получение вина высокого качества, п вся эта микрофлора винограда может причинить суслу и вину при брожении непоправимый вред.

ГЛАВНЫЕ ПРЕДСТАВИТЕЛИ МИКРОФЛОРЫ ВИНОГРАДА

Микрофлора винограда довольно богата. Главным по своей практической ценности представителем является Saccharomyces ellipsoideus (эллиптические дрожжи), которые теперь называются Saccharomyces vini. Это — истинные винные дрожжи, главные агенты спиртового брожения. Некоторые виды сахаромицес вини, например Сахаромицес овиформис, могут образовать 18—19 объёмных процентов спирта.

Рис. 22. Сахаромицес вина.

Кроме Saccharomyces vini, на винограде встречается большое количество других родов и видов дрожжей, которые называются дикими, сорняками, вредителями вина. Среди них можно отметить следующие: различные виды рода Pichia и Hansenula (прежний Willia), принадлежащие к пленчатым дрожжам и образующие на поверхности вина плёнку.

ДРОЖЖИ КУЛЬТУРНЫЕ (ВИННЫЕ)

Частная классификация дрожжей

Рис. 23. Сахаромицес овиформис (хересные).

Дрожжи спиртового брожения по своему строению и биологическим особенностям относятся к грибам семейства сахаромицетов; по способу образования спор это семейство относится к группе сумчатых грибов, носящих ботаническое название аскомицетов. В семейство сахаромицетов входит ряд родов почкующихся грибов, различающихся между собой по форме клеток и спор, способу размножения вегетативных клеток, способу образования и прорастания спор, по способности сбраживать те или иные сахара и по другим свойствам.

Виды дрожжей обозначаются двумя названиями: первое указывает на род, второе обозначает отличительный признак вида. Все полезные дрожжи принадлежат в основном к двум видам: Сахаромицес вини, получивший ранее название Сахаромицес эллипсоидеус по эллипсовидной форме клеток, и Сахаромицес овиформис, имеющий яйцевидную форму.
Каждый вид дрожжей включает большое количество рас,
которые мало отличаются по внешним признакам, но значительно отличаются по ценным для производства физиологическим и биохимическим свойствам, как, например, по силе брожения, т. е. по количеству сахара, которое определённое количество дрожжей способно разложить на спирт и углекислоту за единицу времени, по энергии брожения, т. е. по времени, в течение которого определённое количество дрожжей способно разложить определённое количество сахара, по отношению к воздействиям температур на жизненные функции клеток и по другим признакам.
Известно, что некоторые расы дрожжей вызывают брожение не сразу, а лишь спустя некоторое время после их размножения; при разложении сахара образуют вещества, придающие вину неприятный вкус и запах; после полного выбраживания сразу не оседают, а находятся во взвеси, что затрудняет осветление вина; очень чувствительны к химическим веществам — уксусной кислоте и сернистому ангидриду, —  а также к температурным воздействиям, т. е. к низкой и высокой температуре.
Другие расы дрожжей быстро вызывают забраживание сусла н полно разлагают сахар, образуя при этом вещества, значительно улучшающие вкус вина. Они быстро, ещё во время брожения, оседают на дно, образуя плотный, не взмучивающийся осадок; мало чувствительны к химическим и температурным воздействиям. Поэтому выбор рас дрожжей для виноделия имеет важное практическое значение.

Биология винных дрожжей

Дрожжи представляют собою одноклеточные неподвижные микроорганизмы, относящиеся к сумчатым грибам и обладающие способностью вызывать спиртовое брожение. Форма дрожжей может быть различной. В большинстве случаев форма винных дрожжей эллиптическая, овальная, но некоторые клетки имеют овально-удлинённую и круглую форму длина клеток колеблется от 5 до 12 микронов, ширина — от 3 до 8 микронов.
Форма и размеры дрожжевых клеток непостоянны и варьируют в зависимости от условий культивирования, состава питательной среды, возраста клетки и других факторов. Более постоянную форму имеют клетки в молодых культурах.
Дрожжевые клетки имеют оболочку, через которую в клетку диффундируют необходимые для её питания и роста вещества и выводятся наружу продукты обмена. Толщина оболочки зависит от возраста клетки и её состояния. У молодых клеток оболочка очень тонкая, менее 0,5 микрона, у старых она значительно толще (около 1 микрона, т. е. около 1/10 диаметра клетки).
Химический состав оболочки недостаточно выяснен. Известно, что в ней обнаружены гемицеллюлоза, сложные соединения сахаров и белка, фосфорная кислота, пектин и другие вещества. Оболочка живой клетки обладает избирательной способностью к окружающим её растворённым веществам. Так, например, раствор метиленовой сини не проникает через оболочку в живую клетку, но эта же краска очень легко диффундирует в мёртвую клетку, окрашивая её в интенсивный синий цвет. На этом и основан способ подсчёта количества мёртвых клеток в исследуемых дрожжах.
В оболочках молодых клеток обнаружено незначительное количество белкового вещества — хитина; в оболочках старых клеток его значительно больше. Как показали исследования с помощью электронного микроскопа, оболочка состоит из двух слоёв (мембран). Внутренняя оболочка — это полупроницаемая мембрана плазмы, пропускающая воду и растворённые в ней вещества с небольшим молекулярным весом; наружная мембрана пропускает значительно больше веществ. Каждая отделившаяся дочерняя клетка оставляет на мембране рубец.
Внутреннее содержимое клетки состоит из протоплазмы, ядра, вакуолей. Протоплазма, занимающая большую часть клетки, бесцветна, под микроскопом выглядит гомогенной (однородной) и оптически пустой. В живой протоплазме происходят все жизненно важные процессы, в частности, обмен веществ клетки. Протоплазма дрожжевой клетки обладает избирательной способностью. Так, например, она не может воспринимать из раствора сахарозу, тогда как глюкоза, фруктоза, органические кислоты и минеральные соли проходят через неё легко.

Важнейшая часть клетки — это ядро.

При почковании оно делится, и одна часть его переходит во вновь образующуюся дочернюю клетку (почку). При спорообразовании ядро делится на столько частей, сколько образуется спор.
Вещества, поступившие в протоплазму, подвергаются в ней сложным превращениям. Часть их употребляется на образование самой протоплазмы и оболочки клеток; другая часть служит источником энергии, необходимой для поддержания различных жизненных процессов дрожжей, и выделяется обратно в среду в изменённом виде.
Вакуоли представляют собою внутриклеточные полости, окаймлённые плазмой и наполненные прозрачной жидкостью — клеточным соком. Последний представляет собою водный раствор органических и минеральных веществ (сахаров, органических и минеральных кислот, азотистых веществ).

Круглые клетки дрожжей содержат обычно одну вакуолю, а удлинённые — две, расположенные у противоположных концов клетки и соединённые плотным мостом из протоплазмы.
Вакуоли играют большую роль при осмотических явлениях в клетке. В настоящее время вакуолям придаётся громадное значение в самом акте обмена веществ. В вакуолях происходит накопление различных химических веществ в виде солей, особенно калия, кальция, хлора и фосфора, и протекают энергичные окислительно-восстановительные процессы. Вакуоли накапливают (аккумулируют) из окружающей среды также некоторые органические соединения, которые подвергаются затем ферментативным превращениям. В вакуолях обнаружены различные ферменты — цитрохромоксидаза, пероксидаза, протеаза и др. Находящиеся в протоплазме хондриосомы разбросаны в виде удлинённых телец, играющих важную роль при обмене веществ.

Клетки дрожжей содержат также запасные вещества. Вот наиболее важные из них:

1. Гликоген — полисахарид, родственный крахмалу растений и называемый животным крахмалом. Содержание гликогена в дрожжевых клетках нередко достигает 30—40% от веса сухих веществ клетки. Он находится почти во всех дрожжах, за исключением некоторых заостренных дрожжей. Появляется гликоген в начале брожения в виде мелких пятен, разбросанных в протоплазме, которые быстро сливаются в общую массу, отодвигающую вакуоли и ядро к периферии клетки. К концу брожения гликоген постепенно исчезает. Когда дрожжи образуют споры, он аккумулируется в асках и используется как запасное вещество при образовании спор.
2. Волютин.

По химическому составу волютин дрожжей близок к производным нуклеиновой кислоты (метохроматические тельца). В процессе жизнедеятельности клетки содержание волютина подвергается сильным колебаниям, что свидетельствует в известной мере о роли его как запасного питательного вещества клетки, расходуемого и накапливаемого ею в зависимости от окружающих условий. Особенно много волютина появляется в клетке перед почкованием. При почковании часть волютина из материнской клетки переходит в дочернюю клетку, а при спорообразовании — в споры.

1. Жировые включения.

У винных дрожжей они располагаются в виде мелких капель, видимых при специальном окрашивании, а у плёночных (например, у торулы) — в виде 1—2 больших капель, хорошо различимых под микроскопом и без окрашивания.
Дрожжевые клетки очень богаты ферментами (энзимами). Их значение в жизнедеятельности клетки очень велико. Они по существу, определяют направление и скорость химических реакций одним только своим присутствием.
К внеклеточным ферментам (экзоферментам) дрожжей относится инвертаза (сахараза). Благодаря ей дрожжи могут усваивать сахарозу, предварительно превращая её в глюкозу и фруктозу.
К внутриклеточным ферментам (эндоферментам) дрожжей относится зимаза — бродильный фермент или, вернее, комплекс бродильных ферментов. С помощью зимазы осуществляется сложный процесс превращения моносахаридов — глюкозы и фруктозы — в этиловый спирт и углекислоту. Последние диффундируют из дрожжевой клетки в бродящее сусло. Углекислота при этом большей частью уходит в воздух, а спирт накапливается, превращая сусло в вино. Таким образом, процесс спиртового брожения происходит так, что весь сахар должен пройти через живое тело дрожжевой клетки.

Размножение дрожжей

Спорогенные дрожжи в зависимости от условий могут иметь два способа размножения — вегетативное размножение почкованием и размножение образованием спор, которые после прорастания снова дают дрожжи. Аспорогенные дрожжи размножаются только вегетативным путём.
Процесс почкования состоит в том, что на оболочке материнской клетки, обычно на более заострённой части, образуется шарообразная выпуклость, которая всё увеличивается и превращается в почку. Дочерняя клетка быстро отделяется от материнской и, достигнув достаточной величины, сама образует почку. Но дочерняя клетка может и некоторое время остаться связанной с материнской и образовать почку, что в конечном счете приводит к образованию колонии.

Почкование идёт быстро. Так, при благоприятных условиях в течение примерно двух часов новообразовавшаяся почка достигает величины и формы материнской клетки. Почкование называется полярным, если новая клетка появляется на одном из концов материнской клетки, биполярным, если почки развиваются на двух концах клетки, и мультиполярным, если почки появляются в различных концах материнской клетки.
По характеру спорообразования винные дрожжи относятся к голосумчатым дрожжам. Споры образуются внутри клетки и находятся в ней, как в сумке. Количество спор обычно от 2 до 4.

Рис. 24. Гигантские колонии винных дрожжей.

Образуются споры бесполым и половым путём. При бесполом спорообразовании ядро клетки делится по числу образовавшихся спор. Каждое повое ядро, превращаясь в спору, покрывается протоплазмой и плотной оболочкой.
Образованию спор половым путём всегда предшествует слияние (копуляция) клеток. У некоторых дрожжей копулируют не клетки, а прорастающие споры. По сравнению с вегетативными клетками, споры весьма устойчивы к неблагоприятным воздействиям. Винные дрожжи, в отличие от плёнчатых, являются факультативными анаэробами, т. е. хорошо развиваются как при доступе кислорода, так и в отсутствие его.

Стадии развития дрожжей

При незначительном содержании спирта в бродящем сусле дрожжевые клетки размножаются настолько энергично, что материнские клетки не успевают накопить запасные вещества (гликоген, жир и пр.). Большинство дрожжевых клеток в этот период находится в стадии почкования. Под микроскопом оболочка таких клеток тонкая, а содержимое клеток имеет вид однородной серовато-голубоватой массы.
Чем выше концентрация спирта, тем медленнее размножаются дрожжи. Так, при 6—8 объёмных процентах спирта почкование клеток вида Сахаромицес вини прекращается; но бродильная их способность при этом всё ещё остаётся высокой. Дрожжи продолжают разлагать сахар на спирт и углекислоту. В этот период дрожжи находятся в стадии брожения и в их клетках накапливаются запасные питательные вещества. Под микроскопом клетки выглядят хорошо упитанными, с немногочисленными вакуолями.
При накоплении в бродящем сусле приблизительно 16 объёмных процентов спирта (независимо от количества оставшегося в сусле несброженного сахара) подавляющее большинство рас дрожжей Сахаромицес вини (эллипсоидеус) теряет свою жизнедеятельность; дрожжи начинают голодать. Состояние голодания заключается в том, что дрожжи вынуждены потреблять свои запасные вещества. Клетки становятся меньше по размеру, содержимое их приобретает зернистое строение.
За периодом голодания дрожжей (если он продолжается слишком долго), наступает стадия отмирания. Мёртвые клетки характеризуются тем, что их плазма отделяется от клеточных оболочек, собирается в центре. Величина клеток становится ещё меньше, чем при стадии голодания; ферменты, расщепляющие белки (протеолитические), начинают разлагать плазму.

Автолиз дрожжевых клеток

Различают самосбраживание и самопереваривание дрожжей. В процессе спиртового брожения в дрожжевых клетках накапливается запасное питательное вещество — гликоген. В стадии голодания дрожжи при помощи вырабатываемых ими ферментов способны превращать этот гликоген в сахар, а последний сбраживать. Это называется процессом самосбраживания. Некоторое увеличение спиртуозности вин после длительной выдержки на дрожжевом осадке и объясняется процессами самосбраживания дрожжей.
Дальнейший контакт вина с дрожжевыми клетками, лишёнными гликогена, вызывает процесс самопереваривания (саморастворение, автолиз) дрожжевых клеток, что связано с потерей жизнедеятельности и разрушением клетки. При этом ферменты разлагают большую часть веществ, из которых состоит клетка. Установлено, что в присутствии воды автолиз клеток идёт главным образом за счёт их углеводов, а при наличии слабой концентрации спирта (5—7%) — преимущественно за счёт белковых веществ клетки.
Немецкий учёный Шандерль указывает, что в виноградных и плодовых винах при нормальной температуре хранения в подвалах автолиз дрожжей проходит крайне медленно. Чем ниже кислотность и выше температура (оптимальная 37°), тем быстрее протекает автолиз. При аэрации сброженного сусла автолитические процессы ещё более запаздывают, так как при этих условиях дрожжи способны переходить в окислительную стадию, потребляя продукты брожения — спирт и кислоты (лимонную, яблочную, винную и янтарную).
Раньше считалось, что вина нельзя обогащать дрожжевыми автолизатами, так как это значительно снижает качество и устойчивость вина. Однако исследования, произведённые советскими биохимиками (Опарин, Сисакян, Попова, Безингер и др.), привели к противоположному выводу. Авторы эти утверждают, что автолизат дрожжей является источником биологических катализаторов. Автолизат, внесённый в бродящее сусло, усиливает биохимические процессы распада и синтеза многих веществ — белков, жиров, углеводов.
Активность автолизатов зависит от температуры, при которой происходит автолиз. Так, например, если автолиз проходит при 40°, все ферменты остаются в активном состоянии, сохраняются также витамины и аминокислоты. В автолизате, полученном при 60—70°, сохраняются только те ферменты, которые осуществляют синтез аминокислот.
Установлено, что высшие спирты происходят из аминокислот в результате азотистого обмена дрожжей, а источником эфиров могут быть ароматические спирты, которые также образуются из аминокислот.
Дрожжевые автолизаты в настоящее время широко используются в спиртовой и витаминной промышленности для питания дрожжей, а также находят себе применение в виноделии. Благоприятное влияние оказывают продукты автолиза дрожжей на качество шампанского. При бутылочной шампанизации такой автолиз происходит в результате 2—3-летней выдержки вина с дрожжевым осадком. При резервуарной шампанизации этого не происходит; поэтому возникла мысль искусственно обогащать шампанизируемые виноматериалы продуктами автолиза дрожжей (лизатами).
Это может быть достигнуто как выдержкой на дрожжах сбродивших виноматериалов (лизатная выдержка), так и искусственным добавлением автолизатов. Так, А. М. Фролов- Багреев и Е. Г Андреевская рекомендовали подвергать шампанские виноматериалы естественному обогащению автолизатами путём выдержки на дрожжах в течение 3—5 месяцев.
При внесении готовых автолизатов вино также обогащается ферментами, витаминами и другими веществами, которые оказывают положительное действие на качество вина. Внесение дрожжевого автолизата повышает содержание и активность окислительных ферментов, играющих значительную роль в окислительно-восстановительных процессах на первых стадиях созревания вина. Оно обогащает вина эстеразами дрожжей, под влиянием которых происходит образование сложных эфиров, улучшающих качество вина. Добавление автолизатов в тиражную смесь ускоряет созревание бутылочного шампанского и улучшает его качество.
При пользовании автолизатами в виноделии необходимо, однако, помнить, что они повышают питательную ценность вина для развития в нём и вредных микроорганизмов, особенно молочнокислых бактерий. Это касается в первую очередь вин с низкой кислотностью.

Распространение дрожжей

Дрожжи широко распространены в природе, однако главным местом их обитания являются зрелые и перезрелые ягоды, плоды, овощи и другие многочисленные объекты, содержащие сахар.
Благоприятной средой для обильного размножения дрожжей являются повреждённые или треснувшие ягоды, из которых вытекает сок, содержащий сахар. На зелёных, незрелых ягодах, поверхность которых покрыта восковым налётом, дрожжи не находят питательных веществ и легко сдуваются ветром или смываются дождём в поверхностные слои почвы, где под влиянием прямых солнечных лучей быстро погибают.
В почве на некоторой глубине (до 50 см) дрожжи находятся в жизнедеятельном состоянии. Вортман ещё в прошлом столетии установил, что почва виноградников, взятая с ноября по март и высеянная в стерильный виноградный сок, всегда вызывала забраживание. Такими же опытами было доказано, что почва весной и летом обеднялась флорой дрожжей, а с наступлением периода созревания ягод вновь обогащалась активными дрожжами.
Особенно большое количество дрожжей обнаруживается в почве, обогащённой сахарсодержащими частями растений (почва садов, ягодников и овощных культур).
Дрожжи заселяют поверхность виноградных ягод по мере их созревания. Так, если несколько зелёных ягод поместить в стерильный виноградный сок, то брожение возникает очень редко, а если в такой же сок поместить зрелые или перезрелые ягоды, то брожение наступит через несколько часов.
На повреждённых и гнилых зрелых ягодах поселяются не только винные дрожжи, но и многочисленные представители других микроорганизмов — различные виды дрожжей, уксусных и молочнокислых бактерий, а также плесеней. Дрожжи можно часто обнаружить в нектарниках цветов плодовых и ягодных культур (нектарниковые дрожжи), куда они заносятся насекомыми. Среди нектарниковых дрожжей преобладают слабобродящие, но нередко можно встретить и винные дрожжи.
Большое количество дрожжей скопляется на стенах подвалов, винодельческих помещений и аппаратуры, но особенно на внутренних стенках винодельческой деревянной посуды.
Дрожжи, живущие на стенах винных помещений, приспособились использовать для своей жизнедеятельности вещества в газовой фазе, т. е. из воздуха винохранилищ. На охлаждаемых поверхностях помещений (подвалов) часто конденсируется водяной пар, с примесью паров спирта, эфиров, альдегидов, аммиака, сернистого ангидрида и других веществ, выделяющихся при брожении сусла и переливках вина.
Наконец, местом обитания дрожжей являются животные, особенно насекомые (пчёлы, шмели, осы, мушка дрозофила и др.). Уксусная мушка дрозофила, обладая исключительно развитым обонянием (она сразу же появляется там, где начинают забраживать сладкие соки), является главным переносчиком не только уксуснокислых бактерий, по и многочисленных видов дрожжей. Анализируя дрожжевую флору пищеварительного канала уксусной мушки, исследователи выделили тринадцать различных видов и родов дрожжей.
Вопрос о том, как попадают дрожжи на виноградные ягоды, являлся предметом многих исследований. В настоящее время считают, что основными переносчиками дрожжевых организмов на виноградные ягоды являются различные насекомые. Кроме того, пыль, переносимая сильными ветрами через сады и виноградники, может увлекать с собой и дрожжевые клетки. Брызги дождя, попадая на ягоды, расположенные близ почвы, могут переносить на них частицы почвы, а следовательно, и обогащать их дрожжами. Прямые подсчёты клеток дрожжей, проведённые Шандерлем, показали следующее (в млн. на 100 шт. ягод).
Таблица 4

Примечание. Сберулина интермикста в виноградном соке образует почкующиеся клетки, похожие на клетки дрожжей. Обладает слабой спиртоустойчивостью, поэтому быстро подавляется винными дрожжами. Если же в соке винные дрожжи отсутствуют, Сферулина может превратить его в клейкую вязкую массу (студень).

Круговорот дрожжей

Многие исследователи занимались изучением вопроса, где находятся дрожжи в различное время года и каким путём они попадают на плоды.
Ещё в 1880 г. Гансен экспериментально доказал, что основ-, ным местом обитания дрожжей в течение лета и осени являются повреждённые сладкие сочные плоды и ягоды. Винные дрожжи встречаются также на поверхности почвы и в ней самой до глубины 20—30 см во все времена года. Особенно много их обнаруживается в период созревания плодов и ягод.
По данным Тюниной, дрожжи могут проникать в почву на различную глубину, в зависимости от характера почвы, её физикохимических свойств и метеорологических условий. Так, например, в условиях Кубани ею найдены дрожжи на глубине 160 см. Другие исследователи также считают, что почва является местом обитания дрожжей, так как по своим физико- химическим свойствам она является подходящей средой для жизнедеятельности микроорганизмов.
Почвы Южного берега Крыма, по данным Н. Ф. Саенко, менее благоприятны для развития дрожжей, особенно в летние месяцы из-за сильного нагрева, светового воздействия, чередования дождя и засухи, которые губительно действуют на дрожжевые организмы.

Н. Ф. Саенко установила, что кусты винограда и воздух Южного берега Крыма очень бедны дрожжами вообще и винными, в частности. На цветах и ягодах винограда винных дрожжей она не обнаружила.

Таким образом, по данным Н. Ф. Саенко, главным местообитанием дрожжей в условиях Южного берега Крыма является пищевой канал насекомых, в особенности дрозофилы, а почва служит лишь для временного пребывания дрожжей.