Выделение отдельных видов
Сенная палочка
(Bacillus subtilis) широко распространена в природе и в большом количестве содержится в сене, которое поэтому используется как материал для её накопления. При этом основываются на свойстве сенной палочки образовывать очень устойчивые споры, выдерживающие нагревание до 100° в течение 20 минут и более, тогда как большинство других бактерий, встречающихся в сене, при этих условиях погибает. Для получения этого микроба помещают в колбу ёмкостью 250—300 мл мелко изрезанное сено на 1/3 ёмкости, насыпают немного мела для нейтрализации и заливают водой на 2/3 объёма. Закрывают ватной пробкой и кипятят 10 минут, после чего помещают в термостат при 20—30° Через два дня на поверхности сенного настоя развивается серовато-белая плёнка, состоящая в основном из бактерий сенной палочки.
Картофельная палочка
(Bacillus mesentericus) широко распространена в природе, в частности в почве, откуда она и попадает на поверхность клубней картофеля. Последний служит материалом для её выделения. Основанием является, как и в предыдущем случае, образование очень устойчивых спор, центрально расположенных. Промытые клубни картофеля нарезают ломтями толщиной 0,5 см. Ломти эти натирают с двух сторон мелом для нейтрализации сока, укладывают в чашку Петри, нагревают в течение 10 минут при 100° в кипятильнике Коха и помещают в термостат на 2—3 дня при 25—30°. На картофеле образуется плотная морщинистая плёнка, состоящая из крупных палочек, часто соединённых в цепочки.
Уксуснокислые бактерии
Эти бактерии окисляют спирт в слабых растворах кислородом воздуха в уксусную кислоту. Будучи аэробами, они развиваются на поверхности жидкости, образуя плёнку. Накопление уксусных бактерий для их изучения основано на их устойчивости к спирту и уксусной кислоте. Материалом служит вино или пиво, которые наливают небольшим слоем в колбочку и слегка подкисляют уксусной кислотой, чтобы исключить развитие плёнчатых дрожжей. Колбочку помещают открытой в термостат при температуре 30—35° На поверхности жидкости появляется плёнка уксуснокислых бактерий.
Маслянокислые бактерии
Будучи анаэробами, они не переносят доступа кислорода. Поэтому для их выращивания требуется создание анаэробных условий. Этого можно достичь разными способами. Самым простым является выращивание в высоком слое среды. Для этого пробирку наполняют на 1/3 объёма кусочками сырого, нечищенного картофеля. Добавляют 0,5—1,0 г мела для нейтрализации и заливают водопроводной водой на 2/3 объёма. Пробирку закрывают резиновой пробкой (иногда для затруднения доступа воздуха наливают поверх воды слой масла) и прогревают при 80° в течение 15 минут. Затем помещают в термостат при 30—35°. Через 2—3 дня начинается маслянокислое брожение, сопровождающееся выделением газов; появляется запах масляной кислоты. В осадке обнаруживаются маслянокислые бактерии.
Перевивка или пересев микроорганизмов
В микробиологической практике часто приходится переносить микроорганизмы из одной питательной среды в другую. Этот приём называют пересевом, или перевивкой. Перевивку применяют для выделения чистой культуры, для улучшения питания микроорганизмов (так как при длительном разведении их на питательной среде последняя истощается), для длительного хранения микроорганизмов в музейных культурах, для омоложения культур.
При пересеве следует помнить, что основным условием является соблюдение стерильности, не допускающее попадания микроорганизмов извне — с рук, одежды, воздуха. При наличии бокса перевивку следует проводить в нём. Если бокса нет, то пересев осуществляется в стерильном ящике Ганзена, который предварительно обтирают внутри влажной щёткой и спиртом или 0,1%-ным раствором сулемы.
Рис. 58. Выливание среды в чашку Петри.
Протёртый ящик оставляют на час для оседания микроорганизмов, а затем приступают к пересеву. Перед этим руки хорошо моют мылом и протирают спиртом. Стол, за которым работают, чисто протирают. В комнате не должно быть лишнего движения.
Все операции по пересеву следует проделывать по возможности быстро, чтобы уменьшить возможность проникновения микробов извне. Следует помнить, что микроорганизмы из воздуха оседают вертикально, поэтому открытые пробирки следует держать почти горизонтально, а чашки Петри — слегка приоткрывать с одного края, не снимая крышки. Перед тем как открыть ватные пробки, их обжигают пламенем спиртовки, а перед тем, как закрыть ими посуду, обжигают внутреннюю часть пробки.
Пересев производят металлической петлёй или стерильной пипеткой. Петлю до и после пересева прокаливают до покраснения проволоки.
Последовательность операций при пересеве следующая. Левой рукой захватывают между указательным и большими пальцами пробирки с пересеваемой культурой и стерильной средой. Если культура находится в жидкой среде, её предварительно взмучивают. Пробирки держат рядом почти горизонтально и обжигают ватные пробки. Погасив затем пламя на пробках, пробку первой пробирки вынимают мизинцем правой руки, а вторую безымянным пальцем, зажимая их в руке.
Правой рукой берут петлю, обжигают её и вводят в пробирку с пересеваемой культурой. Держат её прислонённой к стеклу 15—20 секунд для охлаждения. Затем набирают каплю жидкости или осадка и быстро переносят в пробирку со стерильной средой. Если переносят в жидкую среду, то петлёй взбалтывают жидкость. Если пересев производится на твёрдую среду, то касаются петлёй или иглой поверхности среды, делая штрих или укол.
После пересева быстро закрывают пробирки пробками, обжигая их внутреннюю часть и закрывая затем горящими пробками. При пересеве больших количеств жидкости, более 0,5 мл, пользуются стерильными пипетками. Перед употреблением их освобождают от бумаги, набирают необходимое количество среды с пересеваемыми микроорганизмами и переносят в пробирку со стерильной средой. При посеве в чашки Петри поступают так же. Чашку слегка приоткрывают левой рукой, а правой вносят пересеваемый материал.
Выделение чистых культур
Поскольку изучение микроорганизмов возможно только в виде чистой культуры, выделение её является исходным моментом всякого микробиологического анализа. Чистой культурой называется культура микробов, являющихся потомством одной клетки. В настоящее время существует много способов выделения чистых культур. Самым старым из них является метод разбавления, предложенный Пастером. Он был разработан ещё тогда, когда не были известны твёрдые питательные среды. Сущность его заключается в следующем: берут ряд пробирок со стерильной питательной средой.
Рис. 61. Шпатель Дригальского.
В первую пробирку вносят каплю исследуемой среды, перемешивают, каплю полученной взвеси переносят во вторую пробирку, из второй в третью и т. д., до тех пор, пока теоретически разбавление не достигнет такой степени, когда в пробирке окажется всего одна клетка. Потомство её и будет составлять чистую культуру. Метод этот несовершенный, так как не может быть уверенности, что в пробирке окажется только одна клетка, и именно нужная форма.
С введением в микробиологическую практику твёрдых сред выделение чистых культур стало гораздо проще. Предложенный Кохом метод пластинчатых культур в несколько изменённом виде применяется и сейчас. В основе этого метода также лежит приём разведения. Однако, если даже в среде окажется не одна, а несколько клеток, то при прорастании они образуют колонии, расположенные на некотором расстоянии друг от друга, которые могут служить исходным материалом для выделения чистых культур.
Техника этого метода такова. Берут три стерильные чашки Петри и разливают в них стерильную агаровую среду. Когда температура чашки станет терпимой для тыльной стороны руки (среда не должна ещё застыть), вносят каплю исследуемого материала в чашку № 1, перемешивают петлёй и, вынув петлю, переносят её в чашку № 2, а затем в чашку № 3. Таким образом достигается постепенное разбавление микроорганизмов. Чем меньше было микробов, тем реже расположатся колонии, вырастающие из каждой клетки.
Если микроорганизмов в среде очень много, разбавление делают ещё больше. Чашку № 3 помещают в термостат при температуре оптимальной для данного микроорганизма; через 2—3 дня из неё делают пересев (после микроскопирования). Иногда для большей уверенности выделенную культуру разбавляют стерильной водой и повторяют вновь разбавление в трёх чашках Петри.
Рис. 62. Микроманипулятор, смонтированный вместе с микроскопом.
Некоторые авторы (Фёдоров) рекомендуют производить разбавление в пробирках, содержимое которых потом выливают в чашки. Д. К. Чаленко рекомендует дать питательной среде хорошо застыть в чашках Петри (не менее двух часов), после чего внести каплю исследуемой среды в первую чашку и стерильным шпателем размазать её по среде. Этим же шпателем проводят затем по поверхности застывшей питательной среды во второй чашке, а затем в третьей. Этот метод применяется для выделения чистых культур бактерий и плесневых грибов.
При выделении плесеней из одной споры Чаленко рекомендует поступать следующим образом. В стерильную чашку Петри выливают 5 мл прозрачной желатиновой среды и дают ей застыть. На застывшую среду в разных местах наносят капли стерильной воды с разбавленными спорами. За прорастанием спор наблюдают под микроскопом и отмечают те места, где споры расположены поодиночке.
Для выделения чистых культур дрожжей используют метод Линднера. Исследуемый материал разбавляют стерильным суслом до тех пор, пока в одной капле под микроскопом не будет обнаруживаться только одна клетка. Затем берут предметное стекло с выемкой и покровное стекло и стерилизуют их на пламени горелки. Вокруг выемки наносят кольцо стерилизованного вазелина. На поверхность покровного стекла чертёжным пером наносят маленькие капельки разбавленного материала в 3—4 ряда по 4 и более капель в ряду. Дыхнув на выемку, переворачивают над ней покровное стекло капельками внутрь, прижимают и замазывают края расплавленным парафином. Препарат микроскопируют и капли, содержащие по одной клетке, отмечают тушью.
Препарат выдерживают в термостате при 25° или при комнатной температуре и, когда дрожжи достаточно размножатся, отмеченные капли пересевают в стерильное сусло. Выделенные культуры подвергают затем всестороннему изучению.
При выделении чистых культур из одной клетки можно ещё пользоваться микроманипуляторами. Это специальные приспособления к микроскопу, позволяющие при помощи микропипетки захватить одну клетку под микроскопическим контролем.
