Обмен веществ, характерный для любого живого организма, слагается из большого числа сложнейших химических процессов синтеза и гидролиза (распада). Для осуществления их в лабораторных условиях требуются сильные реактивы, высокие температуры и давления. Осуществление таких реакций при сравнительно низких температурах в нейтральной среде, как это происходит в теле живых организмов, может происходить только благодаря наличию ферментов (энзим), действующих как катализаторы. Ферменты были открыты в начале XIX века одновременно с неорганическими катализаторами.
В 1814 г. русский химик К. С. Кирхгоф, изучая превращение крахмала в сахар в присутствии разбавленных минеральных кислот, доказал, что этот процесс может происходить и под действием солодовой вытяжки (из проросших зерен) Так был открыт первый фермент диастаз, или амилаза.
В дальнейшем учение о ферментах быстро развивалось и в настоящее время выделилось в специальную науку — энзимологию.
Ферменты являются сложными органическими веществами, вырабатываемыми живыми организмами. Они способны проявлять свое каталитическое действие и вне организма. Ферменты характеризуются следующими особенностями: высокой активностью, специфичностью и лабильностью.
Высокая активность ферментов заключается в том, что ничтожно малое их количество способно вовлечь в химическую реакцию значительную массу реагирующего вещества. Так, например, достаточно одного грамма амилазы, чтобы превратить в сахар целую тонну крахмала. Это объясняется тем, что фермент только выполняет роль катализатора, не входя в состав конечного продукта и не теряя своих первоначальных свойств.
Специфичность ферментов характеризуется тем, что каждый фермент способен вызвать только определенную реакцию. Так, например, фермент диастаз (амилаза) может вызвать гидролиз (расщепление) только крахмала с образованием одного сахара — мальтозы. Другой фермент — мальтаза — в свою очередь расщепляет мальтозу до глюкозы. Такая специфичность действия ферментов вызывает необходимость для организма располагать большим набором различных ферментов. Этот набор и определяет возможности каждого организма в части биохимических реакций.
Лабильность ферментов — это их неустойчивость в отношении различных неблагоприятных условий среды, таких как высокая температура, присутствие солей тяжелых металлов, высокая кислотность среды и пр. Эта неустойчивость выражается в потере активности фермента и в его разрушении. Лабильность ферментов является следствием их белковой природы.
В изучении химической природы ферментов большую роль сыграли работы Вильштеттера, Михаэлиса, Бухнера, Самнера, советских ученых А. Н. Баха и А. И. Опарина. До недавнего времени, на основе исследования Вильштеттера, ферменты рассматривались как небелковые соединения коллоидного характера, с высоким молекулярным весом. Наличие белкового вещества допускалось лишь в виде пассивного коллоидного носителя, на котором адсорбировано активное начало. Связь между этими частями считалась настолько непрочной, что предполагалась возможность существования каждой части как самостоятельного фермента, лишенного активности. В этом случае один из компонентов называли апоферментом, а другой — коферментом.
После того как в 1926 г. американскому ученому Самнеру удалось выделить в кристаллическом виде фермент уреазу, взгляды на химическую природу ферментов сильно изменились. Позднее (1930—1931 гг.) был выделен Нортропом кристаллический пепсин и трипсин, а затем еще 20 других ферментов. Все они оказались кристаллическими белками, что позволило считать ферменты белковыми веществами. Изучение ферментов показало, что большинство из них, кроме белка, содержит и второй компонент.
Таким образом, некоторые ферменты следует рассматривать как двухкомпонентные системы, состоящие из коллоидного носителя белкового характера и небелковой простатической группы. Обе составные части фермента являются одинаково важными в определении характера фермента, и каждая в отдельности активности не проявляет. При этом простетическая группа определяет каталитическую способность фермента, а белковая — специфичность фермента. Каталитическая способность ферментов зависит в значительной мере от их коллоидной природы, создающей большую адсорбционную поверхность. По современным взглядам, ферменты сами участвуют в реакциях, давая промежуточные нестойкие соединения, но в состав конечных продуктов не входят.
По своей химической природе все ферменты делятся на три группы: 1. Ферменты-протеины, представляющие собою кристаллические белки. 2. Ферменты-протеины, в состав которых, кроме белка, входят ионы металла, необходимого для их активности. 3. Ферменты-протеиды, имеющие в своем составе простетическую группу и коллоидный носитель белкового типа. Белковая природа ферментов обусловливает их высокий молекулярный вес (пепсин — 36 000, уреаза — 483 000) и лабильность. Высокий же молекулярный вес обусловливает коллоидное их состояние. Ферменты, так же как белки и аминокислоты, являются амфотерными электролитами.
Влияние различных факторов на активность ферментов
Активность ферментов находится в зависимости от различных факторов внешней среды, в первую очередь от температуры и реакции среды. Температура влияет на ферментные реакции так же, как и на другие химические реакции, подчиняясь закону Вант-Гоффа, согласно которому при повышении температуры на 10° скорость реакции возрастает в 2—3 раза. Однако, в отличие от других химических реакций, ферментные реакции протекают в очень узком интервале температур — 0—60°, так как большинство ферментов при более высоких температурах инактивируется.
Оптимальная температура для различных ферментов не одинакова. Для большинства ферментов она лежит в пределах 30—40° При 40—50° некоторые ферменты уже начинают разрушаться. Другие выдерживают нагревание до 70° Их называют термостабильными. При 80° почти все ферменты разрушаются. При температурах ниже оптимальной скорость ферментативных реакций замедляется, а при температурах, близких к нулю, и особенно ниже нуля, ферментные реакции замедляются в большей степени, чем это следовало бы ожидать по правилу Вант-Гоффа, хотя при этих температурах разрушение фермента не происходит.
Реакция среды тоже оказывает большое влияние на активность ферментов. При этом одни ферменты лучше действуют при кислой реакции среды, другие — при нейтральной, третьи — при слабощелочной. В зависимости от происхождения одноименные ферменты нуждаются в разной концентрации водородных ионов. Так, например, для солодовой амилазы оптимальной реакцией будет pH 4,4—4,5, а для слюнной амилазы (птиалина) — 6,8.
На скорость энзиматических реакций влияют также концентрации субстрата (разлагаемого ферментом вещества) и концентрация самого фермента. При этом, когда концентрация субстрата малая, а фермент находится в избытке, скорость ферментативной реакции падает. То же наблюдается при избытке субстрата. При оптимальных концентрациях субстрата скорость ферментативной реакции прямо пропорциональна концентрации фермента.
Кроме перечисленных факторов, на активность ферментов влияют различного рода химические вещества. При этом одни вещества активируют деятельность ферментов (активаторы), другие замедляют или парализуют её (парализаторы, ингибиторы).
Различают три типа активации ферментов:
- Отсутствие активатора ведёт к почти моментальной потере активности фермента, например, животная амилаза очень мало активна в бессолевом растворе, а прибавление небольшого количества поваренной соли очень сильно активирует её (активатором в данном случае является ион хлора).
- Отсутствие активатора ведёт к частичной потере активности фермента, т. е. выпадает определённая промежуточная реакция. Так, активатором зимазы (бродильного фермента) дрожжей является козимаза. Отсутствие последней влечёт за собою выпадение одной из промежуточных стадий превращения сахара в спирт.
- Отсутствие активатора влечёт за собою уменьшение активности фермента. Активация в данном случае сводится к созданию условий, наиболее благоприятных для действия фермента. Так, активатором липазы (фермент, расщепляющий жиры) будет вещество, способствующее растворению жира, благодаря чему устанавливается контакт фермента с субстратом.
В тканях и клетках многие ферменты находятся в неактивной форме и только при определённых условиях становятся активными. Неактивная форма фермента называется проферментом. Например, пепсин выделяется в виде профермента пепсиногена, который под действием соляной кислоты желудка превращается в пепсин.
Парализаторы ферментов встречаются чаще, чем активаторы и в своем действии не специфичны. К парализаторам относятся соли тяжелых металлов (серебра, ртути, меди, свинца), анилин. Во многих случаях это явление, т. е. парализация фермента, бывает обратимым. Например, связывая металл сероводородом, можно восстановить активность фермента. Парализующее действие вещества может быть также следствием изменения реакции среды. Одно и то же вещество может быть активатором одного фермента и парализатором другого. Так, синильная кислота, будучи парализатором окислительных ферментов, является специфическим активатором растительных протеаз.
Парализаторами биологического происхождения являются антиферменты. Так, слизистая оболочка желудка не переваривается пепсином вследствие выделения ею антипепсина. Кишечные паразиты вырабатывают целый ряд антиферментов (антипепсин, антитрипсин, антихимозин), предохраняющих их от переваривания ферментами пищеварительных соков.
Обратимость ферментативных реакций
В живой клетке наряду с процессами распада протекают и синтетические реакции. Можно было думать, что наряду с ферментами распада должны быть и ферменты синтеза. Однако таковые не были найдены. Рядом работ установлено, что ферменты, как и неорганические катализаторы, способны ускорять не только прямую, но и обратную реакцию.
Ещё в начале прошлого века была доказана возможность синтеза дисахарида из глюкозы с помощью фермента. Исследования русского учёного А. В. Благовещенского показали, что для синтетической работы фермента большое значение имеет энергетический фактор, т. е. синтез происходит в том случае, если в клетке параллельно с этим процессом протекает еще другая — экзотермическая реакция.
Работы русского учёного А. Н. Баха показали, что та часть фермента, которая участвует в синтезе, более тесно связана с протоплазмой клетки, чем часть, производящая расщепление. Её не удаётся отделить от фермента с такой же лёгкостью, с какой может быть получена расщепляющая часть фермента.
Выделение и очистка ферментов
Будучи катализаторами химических процессов, протекающих в живых организмах, ферменты образуются и действуют в клетках, откуда и могут быть выделены. Некоторые ферменты легко выделяются живыми клетками наружу, где они и проявляют своё действие. Такие ферменты называются экзоферментами. К ним относятся ферменты пищеварительных соков, а также некоторых микроорганизмов, служащие для внеклеточного действия (гидролиз крахмала). Но большинство ферментов при жизни клетки из неё наружу не выделяется. Такие ферменты называют эндоферментами. Например, зимаза дрожжей при жизни клетки наружу не выделяется, и превращение сахара в спирт и углекислый газ с её помощью происходит внутри каждой дрожжевой клетки.
Понятно, что получение экзоферментов значительно легче, чем эндоферментов. Для выделения последних надо сначала разрушить клеточную структуру, что достигается различными способами. Иногда применяют растирание клеток с песком или растирание замороженных клеток. В некоторых случаях растирают клетки, высушенные при 35—40°.
Для извлечения внутриклеточных ферментов используют также мощные ультразвуковые волны, вызывающие разрыв клеточных оболочек. После разрушения клеток ферменты извлекаются водой, глицерином или другими растворителями. При исследовании ферментов дрожжей часто применяют метод автолиза (самопереваривания). Клетки убивают хлороформом или толуолом, безвредными для ферментов. В мёртвых клетках деятельность ферментов носит несогласованный характер, происходит расщепление составных частей клетки благодаря деятельности протеолитических ферментов. При этом ферменты, прочно связанные с белковым веществом, освобождаются и переходят в раствор. Однако при такой обработке некоторые ферменты, как, например, зимаза дрожжей, полностью инактивируются.
Выделенные тем или иным способом ферменты содержат много примесей, от которых следует их освободить. Очистка ферментов от примесей производится различными способами. Соли и другие низкомолекулярные вещества отделяют способом диализа, т. к. ферменты, имеющие коллоидный характер, не способны проходить через полупроницаемые перегородки. Освобождение ферментов от белков, полисахаридов, пектиновых веществ производится путём последовательного осаждения спиртом или ацетоном и извлечения водой, что повторяют несколько раз. Однако следует помнить, что применяемые для осаждения вещества не являются индифферентными для ферментов и приводят к их частичной инактивации.
Наилучшим методом очистки ферментов является применение адсорбции на специально подобранных адсорбентах (гидраты окиси алюминия, железа, хрома, каолин), которые, будучи применены последовательно, позволяют не только очистить фермент от примесей, но и разделить смесь нескольких ферментов или отделить фермент от кофермента.
Этот метод избирательной адсорбции был впервые предложен русским биохимиком А. Я. Данилевским в 1862 г. Позднее этот метод был разработан русским ботаником М. С. Цветом (1906 г.) в виде хроматографического анализа.
Номенклатура и классификация ферментов
Номенклатура ферментов складывалась по мере их открытия и изучения. Поэтому названия отдельных ферментов носили случайный, эмпирический характер. Так возникли названия: диастаз, пепсин, трипсин. Лишь в конце прошлого века французский учёный Дюкло ввёл рациональную номенклатуру, согласно которой название фермента составляется из корня — названия субстрата, на который он действует, и суффикса «аза». По этой номенклатуре фермент, расщепляющий крахмал (по-латыни крахмал — амилум), называется амилазой, расщепляющий сахарозу — сахаразой и т. д. Иногда названия ферментов производят от названия ферментативной реакции. Например, дегидраза — фермент, отнимающий водород, оксидаза — окислительный фермент, редуктаза — восстанавливающий и т. д.
До недавнего времени ферменты делили на две группы — гидролазы и десмолазы. Поскольку не все известные ферменты укладываются в эту классификацию, решено было ферменты условно разделить на следующие группы: 1) гидролазы, 2) ферменты углеводного обмена, 3) окислительно-восстановительные, 4) десмолазы.
- Гидролазы
К гидролазам относятся ферменты, катализирующие процессы расщепления и синтеза веществ по типу гидролитических реакций с присоединением или отнятием воды. В зависимости от субстрата, подвергающегося расщеплению или синтезу, гидролазы подразделяются на три подгруппы: карбогидразы, протеазы, эстеразы.
Карбогидразы гидролизируют различные углеводы и глюкозиды. Эти ферменты широко распространены в организмах животных и растений, в том числе в микроорганизмах. К ним относятся диастаз, или амилаза — фермент, вызывающий гидролиз крахмала до мальтозы. Амилаза содержится в слюне и соке поджелудочной железы человека и животных, в растениях, плесневых грибах и многих бактериях. Имеются две разновидности — α и β амилазы, по-разному действующие па со ставные части крахмала — амилозу и амилопектин. Амилаза расщепляет амилозу на мальтозу почти нацело, а амилопектин только на 54% с образованием декстрина с большим молекулярным весом. В результате совместного действия α и β амилаз крахмал превращается в мальтозу примерно на 95%.
Пектиназа и пектаза вызывают гидролиз растворимых пектинов с отщеплением редуцирующих сахаров. Близок к ним и фермент протопектиназа, расщепляющий нерастворимый пектин (протопектин) растительных тканей. Пектаза содержится в высших растениях и микроорганизмах, а пектиназа преимущественно в микроорганизмах — плесневых грибах и бактериях.
Целлюлаза — гидролизует целлюлозу (клетчатку) с образованием сахаров. Она встречается в грибах и некоторых бактериях, Мальтаза расщепляет мальтозу на две молекулы глюкозы. Она широко распространена у бактерий, грибов, дрожжей. Сахараза (инвертаза) расщепляет сахарозу на глюкозу и фруктозу. Она содержится у животных, растений и большинства микроорганизмов. Лактаза расщепляет лактозу (молочный сахар) на галактозу и глюкозу. Она широко распространена в животных организмах и у микроорганизмов. Инулаза расщепляет полисахарид инулин до фруктозы. Глюкозидаза расщепляет глюкозиды на сахар и аглюкон (глюкозидный остаток, не содержащий сахара).
Протеазы (протеолетические ферменты) — вызывают гидролиз белковых веществ, а также промежуточных продуктов их распада. Различные протеазы чаще всего действуют совместно, катализируя постепенный гидролиз белков. Протеазы вырабатываются всеми живыми организмами, т. к. без них не мог бы осуществляться белковый обмен в организме. Протеазы делятся на протеиназы и пептазы. Протеиназы осуществляют расщепление белков до пептонов, а пептазы расщепляют пептоны до аминокислот. К протеолитическим ферментам относится пепсин, расщепляющий белковые вещества до пептонов и полипептидов. Он находится в желудочном соке животных и у многих микроорганизмов.
Трипсин расщепляет пептоны и полипептиды до аминокислот. Он вырабатывается поджелудочной железой в виде профермента трипсиногена и, попадая в тонкие кишки, превращается в трипсин под действием особого активатора — энтерокиназа. Подобный фермент содержится у многих микроорганизмов.
Некоторые микроорганизмы содержат фермент желатиназу, при помощи которого они разжижают желатину. Пептидазы вызывают гидролиз пептонов, полипептидов и дипептидов до аминокислот. В их состав входит свыше десяти различных ферментов. Они содержатся в соке поджелудочной железы, в кишечном соке, а также найдены в растительных организмах и микроорганизмах (дрожжевая полипептидаза).
Амидазы, или дезаминазы, разлагают амиды и аминокислоты с отщеплением аммиака или мочевины. Они встречаются в животном и растительном мире, а также у бактерий и грибов.
Нуклеазы расщепляют нуклеопротеиды (ядерные белки) вплоть до отщепления фосфорной кислоты. Они выделены из животных и растительных тканей, но, несомненно, содержатся и у микроорганизмов, разлагающих белковые вещества.
Эстеразы катализируют гидролиз сложных эфиров (эсте- ров) на спирт и кислоту. Они широко распространены в живых организмах, участвуют в обмене жиров. Ферменты, вызывающие гидролиз жиров на глицерин и жирные кислоты, называются липазами.
Фосфотазы расщепляют эфироподобные фосфорсодержащие соединения с освобождением фосфорной кислоты. Они содержатся как в животных и растениях, так и в грибах и бактериях.
- Ферменты углеводного обмена
В эту группу входят ферменты, катализирующие различные реакции углеводного обмена, протекающие с участием фосфорной кислоты.
Фосфорилаза вызывает реакцию, аналогичную гидролизу, где вместо воды участвует фосфорная кислота. Этот фермент содержится в растительных и животных организмах, в грибах, дрожжах и бактериях. С его помощью осуществляется также синтез гликогена и крахмала.
- Окислительно-восстановительные ферменты
К этой группе относятся ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные процессы, связанные главным образом с дыханием. Окисление может быть достигнуто присоединением кислорода, отнятием водорода или электронов. В биологических процессах встречаются все эти три типа реакций. При этом реакции окисления всегда сопровождаются восстановительными реакциями, т. е. наряду с окислением одного вещества имеет место восстановление другого.
Окислительно-восстановительные ферменты делятся на дегидразы и оксидазы.
Дегидразы катализируют реакции дегидрирования (отнятие водорода) субстрата. Они делятся на аэробные и анаэробные в зависимости от того, в каких условиях они действуют. Аэробные дегидразы, передающие активированный водород субстрата непосредственно кислороду с образованием воды или перекиси водорода, называются оксидазами. Анаэробные дегидразы активируют отнятие водорода от окисляемого субстрата и передачу его другому органическому веществу — акцептору в анаэробных условиях. Анаэробные гидразы являются двухкомпонентными ферментами.
Окислительные ферменты, содержащиеся в винограде, а в особенности, вырабатываемые микроорганизмами, играют весьма существенную роль в виноделии. Оксидазы винограда, окисляющие дубильные вещества, вызывают побурение сусел. Более сильные оксидазы этого рода, вырабатываемые плесенями винограда, вызывают быстрое и сильное окисление дубильных и красящих веществ (бурый касс).
- Десмолазы
Так называются ферменты, вызывающие разрыв углеродной цепи. Они имеют большое значение при дыхании и брожениях и встречаются почти во всех клетках. К десмолазам относятся: альдолаза, расщепляющая дифосфогексозу на две фосфаттриозы. Карбоксилаза, отщепляющая углекислый газ от пировиноградной кислоты с образованием уксусного альдегида. Содержится в дрожжах, бактериях, грибах и многих растениях.
Техническое использование ферментов
Ферментные процессы находят разнообразное применение в промышленности. Широко используются процессы за счёт ферментов, содержащихся в самом сырье. При переработке сырья многие ферменты сохраняют свою активность. В такой форме ферментные процессы используются в производстве хлеба, сыра, чая, табака.
При изготовлении хлеба смешивание муки с водой в тесто создаёт условия для действия сохранившихся в муке ферментов, осахаривающих крахмал и расщепляющих белки. Прибавленные затем дрожжи своими ферментами сбраживают образовавшийся в тесте сахар. Образующиеся при этом спирт и углекислый газ, испаряясь при выпечке, создают пористость хлеба. Качество выпекаемого хлеба зависит поэтому как от ферментного комплекса муки, так и от применяемых дрожжей, а также от условий приготовления теста. Мука, лишённая ферментов или, напротив, содержащая слишком активный ферментный комплекс, даёт плохой хлеб.
При изготовлении пива используют солод, т. е. пророщенное зерно ячменя, убитое подсушиванием. Солод размельчают и настаивают с водой при температуре, благоприятной для действия ферментов, которые осахаривают крахмал и расщепляют белки.
Более сложные процессы протекают при обработке чая и табака. Деятельность ферментов в подсушенных листьях чая и табака приводит к приобретению ими ароматических и вкусовых качеств.
Нередко в производстве используются специальные ферментные препараты, обусловливающие быстрое течение химических реакций. Наиболее давно такие препараты применяются в сыроварении. Для створаживания молока используют сычужный фермент (телячьего желудка), содержащий протеазу. Препарат сахаразы применяется в кондитерском производстве при изготовлении помадки.
В производстве вин и соков, особенно плодоягодных, применяется препарат пектиназы, получаемый из плесневых грибов. Он производит расщепление пектина, чем достигается быстрое осветление жидкости (энзиматическое осветление). Ферментное окисление спирта до уксусной кислоты с помощью уксуснокислых бактерий используется в производстве уксуса. Напротив, для виноделия этот процесс крайне нежелателен. Наконец, на работе комплекса бродильных ферментов (зимазы), вырабатываемых дрожжами, основан ряд бродильных производств, в том числе виноделие.
