Производство вина по красному способу - Применение разводки чистых культур яблочно-молочных бактерий

Общие положения.

Иногда яблочно-молочное брожение не получается потому, что не были реализованы необходимые условия. Но оно также протекает плохо или не проходит совсем из-за отсутствия активных бактерий. В таком винодельческом районе, как Бордо, каждый год можно наблюдать, что вина крю из числа наиболее известных благодаря, несомненно, соответствующей микрофлоре очень рано подвергаются яблочно-молочному брожению, тогда как в других местах оно оказывается трудным, а иногда даже и невозможным. Факт, о котором сообщали много раз, что якобы яблочно-молочное брожение легче, протекает в большой массе, чем в небольшом объеме, даже в условиях одинаковой температуры, можно также объяснить разреженностью бактерий и неравномерностью первоначального обсеменения.
Если яблочно-молочное брожение проявляется самопроизвольно хотя бы в одном из чанов (для того чтобы вызвать возможно скорее это первое забраживание, можно провести предварительно легкое раскисление сусла), хорошие результаты получают с помощью смешивания в больших объемах вина, богатого яблочной кислотой, с другим вином, где проходит яблочно-молочное брожение или уже заканчивается. При этом брожение завершается за несколько дней, после чего снова смешивают в том же соотношении и т. д. Этот способ позволяет за несколько недель раскислить большое количество вина, начиная с небольших объемов выбродившего вина, и получить результат, на который при спонтанном брожении потребовалось бы несколько месяцев. Однако ясно и то, что такая практика может столкнуться с законным желанием произвести операцию ассамбляжа через несколько месяцев после завершения яблочно-молочного брожения, когда становится возможным оценить органолептические свойства вин.
Но уже давно поставлен вопрос, нельзя ли вызвать сбраживание яблочной кислоты посевом чистых культур бактерий таким же образом, как с помощью чистых культур дрожжей вызывают спиртовое брожение. Такое использование бактерий яблочно-молочного брожения, несомненно, имело бы большое практическое значение. Внесение в вино чистых культур бактерий сопряжено с трудностями, но они постепенно преодолеваются.
Засев культурами бактерий вина, содержащего яблочную кислоту, в течение длительного времени приводил к неудачам, которые стали почти обычным явлением. Внесенные бактерии не развивались за счет компонентов этих вин. Понятно, что бактерии, размножающиеся в синтетической питательной среде, адаптируются к условиям состава этой среды. Когда их помещают в новую, менее благоприятную среду (вино), они могут вызвать в нем яблочно-молочное брожение только в результате новой адаптации, которая проходит тем труднее, чем больше различий в составе этих сред. По этой причине бактерии, вносимые с виноградом естественным путем, постепенно приспосабливающиеся к условиям среды и селекционируемые в зависимости от нее, всегда имеют более легкие условия для своего развития.
Итак, можно предположить, что этих трудностей можно избежать, создавая условия, возможно более близкие к естественным, т. е. засевая сусло бактериями до начала спиртового брожения. Действительно, результаты получаются неплохие, но этот метод не получил широкого распространения потому, что в случае остановки спиртового брожения возникает определенный риск порчи вина.
В стремлении избежать опасности размножения бактерий делались попытки проводить достаточно массированное обсеменение вина после окончания спиртового брожения, чтобы вызвать яблочно-молочное брожение. Этот метод в свою очередь наталкивается на трудность — обеспечить достаточное количество разводки, необходимое для обработки больших объемов виноматериалов.

Наконец, приходится возвратиться к первоначальной идее обсеменения готового вина, не содержащего более сбраживаемых сахаров. Этот метод получил широкое признание и, хотя он еще окончательно не доработан, является единственным, во всяком случае, во Франции, который применяется на производстве, разводку можно покупать.

Обсеменение сусла до начала спиртового брожения.

Неудачи, наблюдавшиеся при обсеменении вина, можно было, с одной стороны, объяснить трудностями роста бактерий в несвойственной им среде, с другой стороны, тем, что в самопроизвольном яблочно-молочном брожении обсеменению подвергаются виноград и сусло и, таким образом, бактериальные клетки, вносимые с виноградом, размножаются в сахаристом сусле в условиях спиртового брожения, т. е. в более благоприятных условиях. Поэтому было логичным ожидать более удовлетворительных результатов, если разводку вносить непосредственно в сусло до начала спиртового брожения или в момент забраживания. Таким путем можно в какой-то степени воссоздать естественные условия в расчете на то, что брожение пойдет легче и быстрее.
Эта идея получила успешное развитие в работах, которые почти одновременно и независимо друг от друга провели Пейно и Домерк (1959), с одной стороны, и Вебб и Ингрэм (1960) — с другой. По мнению Пейно и Домерка, очень легко в довольно короткое время вызвать яблочно-молочное брожение в лабораторных условиях, если сусло засевать одновременно дрожжами и чистой культурой бактерий. В этих условиях яблочно-молочное брожение обычно начинается немного раньше окончания спиртового брожения и заканчивается через несколько дней.
Такие же наблюдения были сделаны в ходе полупромышленных опытов, когда бактериями засевали виноград. Наконец, яблочно-молочное брожение удалось осуществить на некоторых виноградниках, где оно в спонтанной форме наблюдается как редкое исключение. В табл. 4.26, составленной по результатам лабораторного опыта, показаны влияние рН на начало яблочно-молочного брожения и значение засева сусла бактериями. Для того чтобы оно было, если не закончено, то, по меньшей мере, достаточно интенсивным в течение двух недель, нужно внести на каждый 1 см³ сусла по 10 бактерий при рН 3,3, по 1000 при рН 3,1 и по 100 000 при рН 2,9.

Таблица 4.26
Влияние рН и величины обсеменения среды бактериями на биологическое кислотопоннженне

Обсеменение культурами бактерий, происходящих из одной клетки, оказывается не менее эффективным, чем засев с использованием всей совокупности бактерий, раскисливших вино. Это наблюдение исключает гипотезу о существовании в обычных условиях симбиоза с другими микроорганизмами, которые усиливали бы действие бактерий яблочно-молочного брожения. Было также констатировано, что добавление в этих условиях даже тушевого осадка вина обычно не оказывало столь быстрого и столь глубокого действия, как внесение селекционированных бактерий.
На этом принципе успешно осуществлено практическое применение этого способа, так как засев, необходимый для получения быстро протекающего яблочно-молочного брожения, может быть реализован в практике виноделия.
1 л разводки с 1 000 000 бактерий на 1 мм³, внесенный в чан на 100 гл мезги, создает исходную популяцию 10 000 бактерий на 1 см³, достаточную для того, чтобы вызвать быстрое яблочно-молочное брожение. Результаты, полученные в чане на полупромышленных установках, не всегда были такими постоянными, как при лабораторных опытах, но все же позволили быстрее получить биологическое раскисление. В частности, при засевании бактериями после начала брожения мезги, сульфитированной при 15 г/гл, снижение кислотности происходило так же легко, как и в сусле, не подвергавшемся сульфитации. Следовательно, можно использовать преимущества сульфитирования винограда не опасаясь неблагоприятных последствий этой операции на ход яблочно-молочного брожения. Достаточно лишь подождать, когда после сульфитации проявится спиртовое брожение и не будет больше свободной сернистой кислоты, чтобы внести бактерии.
В конечном счете после этих работ, казалось, достигнута возможность использования в недалеком будущем в практике виноделия бактерий яблочно-молочного брожения, тщательно отобранных по их активности и гомоферментативной характеристике (т. е. не образующих летучих кислот из глюкозы и фруктозы). Основная и единственная трудность заключалась именно в отборе таких рас. Действительно, даже гомоферментативные бактерии могут образовывать летучие кислоты из пентоз. С другой стороны, требовалось определить значение обсеменения таким способом, чтобы размножение бактерий не было интенсивным, пока спиртовое брожение не закончится.
Фактически эту последнюю задачу не удавалось решить удовлетворительным образом до самого последнего времени. Наблюдали (Вебб, 1962; Пейно, 1971) случаи остановки спиртового брожения, сопровождавшиеся развитием бактерий и сильным повышением летучей кислотности, даже в случае мезги, первоначально подвергавшейся сульфитированию. Наконец, неоспоримо, что засев винограда бактериями представляет большую опасность молочнокислого скисания, если спиртовое брожение замедлится или совсем остановится.
Такая опасность молочнокислого скисания остается актуальной, даже если засев бактериями практикуется при спуске вина из чана, проводимом тогда, когда в вине остается всего несколько десятков граммов восстанавливающих сахаров. Однако, по мнению Кунки и сотрудников (1964), если введенная в таких условиях бактериальная прививка достаточно велика, всегда можно получить яблочно-молочное брожение без молочнокислого скисания, как бы ни протекало спиртовое брожение. Гальци и сотрудники (1969) также получили удовлетворительные результаты, проводя обсеменение в таких условиях.
В настоящее время этот способ засева бактерий во время спиртового брожения не применяется. Гальци (1966), Гальци и План (1967) исследовали гомоферментативные молочнокислые бактерии, не использующие ни пентоз, ни лимонной кислоты и, следовательно, не образующие летучей кислотности в винах. Они получили некоторые обнадеживающие результаты, которые еще не нашли практического применения.
Использование неразмножающихся бактерий. Некоторые авторы провели исследование возможности получения разложения яблочной кислоты путем внесения достаточной массы клеток бактерий, способных обеспечить весь ход реакции без дальнейшего размножения. Пейно и Лафон-Лафуркад (1972) показали, что скорость разложения яблочной кислоты при отсутствии роста бактерий изменяется в больших пределах в зависимости от состава вина, расы бактерий и ее обеспеченности яблочно-молочным ферментом. В этом направлении работали и другие ученые (Флеш, 1961), но полученные результаты пока что не нашли практического применения.
В самом деле, для разложения яблочной кислоты в такой форме требуются разводки, которые в достаточно малом объеме содержат большое число активных клеток, богатых яблочно-молочным ферментом. С другой стороны, клетки, добавляемые в таких случаях, быстро теряют свою активность. Лафон-Лафуркад и сотрудники (1968) показали, что регрессия бактериальной популяции, которая сопутствует введению в вино массированной разводки.
сопровождается медленным исчезновением яблочной кислоты. В случае настоящего яблочно-молочного брожения с ростом бактерий яблочно-молочная кислота исчезает очень быстро. В табл. 4.27 показано в зависимости от рН и величины обсеменения исчезновение яблочной кислоты, которое сопутствует изменению бактериальной популяции после массированного обсеменения. Начальное содержание яблочной кислоты было 44 мг-экв/л.

Изменение бактериальной обсемененности яблочной кислоты после засева вина от рН и дозы разводки (Лафон-Лафуркад и сотрудники, 1968)
Таблица 4.27 в зависимости

Наконец, нужно внести очень значительное количество разводки, чтобы получить полное исчезновение яблочной кислоты без размножения бактерий. Лафон-Лафуркад (1975) добился полного исчезновения 5 г/л яблочной кислоты при 30°С за 6 ч, добавляя I г/л Lactobacillus hilgardii ВС2 и за 24 ч при 1 г/л Leuconostoc gracile CF 34. Эти условия на практике неосуществимы.
Следовательно, нельзя считать проблему окончательно решенной, но она заслуживает того, чтобы продолжать ее исследование.
Трудности возбуждения яблочно-молочного брожения при размножении бактерий вне вина можно было бы преодолеть использованием клеток, фиксированных на твердых основах (бентонит, кизельгур, целлюлоза и т. д.) или включенных в гели (полиакриловые, желатиновые и др.) (Барр, 1973). Благодаря этим способам фиксирования можно увеличить среднюю продолжительность активности клеток, частично защищая их от воздействия среды (рН и температура) посредством явлений микросреды. С другой стороны, нужно овладеть методами воздействия на это явление и реализовать исключительно превращение яблочной кислоты, не вызывая какого-либо другого превращения вина.
Что касается энологии, то Барр (1973) сообщает о проводимом в настоящее время во Франции исследовании реактора для уменьшения содержания яблочной кислоты в вине, действующего на принципе использования неразмножающихся клеток Schizosaccharomyces pombe; следовательно, речь идет не о яблочно-молочном брожении, а о разложении яблочной кислоты на спирт и углекислый газ. Можно также рассмотреть вопрос о фиксации ферментных препаратов, экстрагированных из клеток. Есть основания рассчитывать на получение таким путем повышенной устойчивости активности фермента.
Обсеменение вина после спиртового брожения. Учитывая трудности, а может быть, и опасности других форм обсеменения, было логичным детальное изучение возможностей вызывать яблочно-молочное брожение путем инокуляции и роста бактерий в вине, содержащем не более 2 г/л восстанавливающих сахаров. Это единственный способ, который, по крайней мере, во Франции получил сегодня практическое применение, хотя непостоянство получаемых результатов указывает на необходимость его дальнейшей разработки, чтобы полностью овладеть техникой управления этим вторичным брожением.
Лафон-Лафуркад и сотрудники (1968) уточнили трудности развития бактерий, внесенных в вино и связанных с его спиртуозностью и рН. Это развитие обусловлено возможностями адаптации внесенной расы, которые невозможно предвидеть. Большим преимуществом природных бактерий, вносимых с виноградом, по сравнению с чистыми культурами является их лучшая способность к адаптации. По этой причине в лабораторных условиях спонтанное яблочно-молочное брожение происходит всегда быстрее, чем брожение, получаемое при обсеменении этого вина после предварительного обеспложивания.
Кроме того, возникает уже упоминавшееся явление быстрой регрессии популяции живых бактериальных клеток. Это явление имеет общий характер и относится ко всем расам, даже если подготовка разводки включает ее постепенную адаптацию к спирту. В зависимости от условий от 25 до 90% клеток теряют жизнеспособность уже через 48 ч. Затем эта регрессия продолжается более медленно и соответственно расе, природе вина и условиям по истечении срока от 15 дней до 1 месяца популяция уменьшается до одной десятой своего первоначального значения или может вообще исчезнуть (табл. 4.28, графа 2).

Таблица 4.28
Изменение бактериальной обсеменениости после засева красного вина (Лафон-Лафуркад и сотрудники, 1968)

Однако для некоторых рас их развитие в отдельных винах может продолжаться и в этот период регрессии, прежде чем исчезнет полностью популяция внесенных клеток, т. е. после более или менее длительного латентного периода (от одной до четырех недель), в течение которого популяция сильно уменьшается {см. табл. 4.28, графа 3).
Таким образом, большая часть бактерий, внесенных в вино, даже если они обладают устойчивостью к спирту и условиям кислотности, не могут там существовать более или менее длительное время, во всяком случае, они теряют способность к самовоспроизводству. Некоторым устойчивым клеткам удается после определенного периода латентного состояния приспособиться к этой среде, и они начинают размножаться. Суть проблемы обсеменения яблочно-молочными бактериями как раз и заключается в выборе бактерий и подготовке разводки, способной размножаться в данном вине.
Эти же авторы показали, что постепенное исчезновение бактерий не мешает частичной деградации яблочной кислоты согласно описанным выше механизмам, связанным с присутствием ферментов, вносимых с бактериями. Такое исчезновение яблочной кислоты всегда происходит медленно, тогда как во время роста бактерий разложение этой кислоты обычно протекает быстро и полностью.
Для выявления условий, способствующих росту бактерий, Лафон-Лафуркад и сотрудники (1968) провели многочисленные опыты, которые показали, что нет достаточных оснований рассчитывать на улучшение яблочно-молочного брожения путем внесения активирующих продуктов с целью уменьшения регрессии и сокращения латентного периода. Эффективным бывает только некоторое повышение рН, которое можно рассчитать на небольшом объеме вина, засеваемом первым. С другой стороны, эти авторы получили обнадеживающие результаты, используя разводки, получаемые засеванием среды (дважды разведенный виноградный сок, к которому добавляют 5 г/л дрожжевого экстракта, 10% этанола и рН приводят к 4,8) смесью дрожжей и бактерий. Через три дня инкубации при 25°С спиртовое брожение заканчивается и микробиальная культура продолжает развиваться в среде, содержащей спирт. Полученные, таким образом бактерии обладают большей спиртовыносливостью.
Весь осадок, состоящий из дрожжей и бактерий, после центрифугирования и промывки можно использовать в смеси или же удалить из него большую часть дрожжей путем дифференциального центрифугирования в течение нескольких минут при частоте вращения 3000 об/мин. Затем проводят новое центрифугирование при скорости 9000 об/мин, при котором собирают бактерии. Засевание вместе с фугатом (остатком от центрифугирования) свежих микроорганизмов дает удовлетворительные результаты, но его трудно применить в практике виноделия ввиду значительности необходимых для этого объемов фугата. Использование лиофилизата или разводки в порошке, приготовляемой особым способом, было бы наиболее практичным при условии, что эта разводка сохранит свойства свежих клеток.
Из практических опытов, проведенных на винодельческих предприятиях в районе Бордо, вытекает, что свежие клетки Leuconostoc gracile CF34 (от 60 до 100 мг/л) вызывают яблочно-молочное брожение, завершающееся за 8 дней при 18°С. Хорошо известно, что массированный засев (10⁶ клеток на 1 см³) является основным условием успеха. Даже если клетки, получаемые при размножении одного и того же штамма, не все идентичны, обильная доза разводки повышает шансы иметь расы, способные адаптироваться к условиям среды, и соответственно облегчает рост бактерий. Понятно, что в этих условиях облегчается химическое разложение яблочной кислоты без роста бактерий, но возможно, что эта деградация обеспечивает более легкое размножение бактерий после массированного обсеменения.
Учитывая трудность обеспечения винодельческих предприятий разводкой с такой концентрацией бактериальных клеток, которая была бы достаточна для засева больших объемов вина, Ардэн (1972) предложил способ, основанный на том, что лиофилизованная разводка реактивируется и размножается на производстве в соответствующей питательной среде, поставляемой вместе с разводкой. В настоящее время это единственный способ, получивший промышленное применение во Франции.
Для приготовления такой разводки используют пакет, содержащий 1 г порошка лиофилизованных бактерий яблочно-молочного брожения, и флакон вместимостью 500 см³ со стерильной питательной средой, состав которой, обеспечивает возможность максимального развития бактерий. Условия приготовления разводки и питательной среды неизвестны.
Содержимое пакета высыпают в питательную среду, затем взбалтывают, чтобы получить хорошую дисперсию бактерий. Флакон выдерживают при температуре, которая не должна опускаться ниже 20°С и подниматься выше 23°С. Через три дня популяция этой культуры достигает 1—1,5 млрд. зародышей на 1 см³. Это соотношение остается постоянным в течение 6—8 дней, после чего постепенно уменьшается.
Для того чтобы иметь максимум шансов на успех, лучше всего эту разводку добавлять в вино при спуске из чана, сразу же по окончании спиртового брожения. Авторы считают эту рекомендацию очень важной. Чем дольше не проводить обсеменения, тем более длительным будет яблочно-молочное брожение и тем больше риск неудачи.
Приготовленная таким образом доза разводки рассчитана на засев 10— 100 гл вина, которое должно иметь рН не меньше 3,3, температуру 18—25°С и свободного сернистого ангидрида не более 5 мг/л. Если хотя бы одно из этих условий не будет выполнено, этот способ будет иметь мало шансов на успех. Если яблочно-молочное брожение протекает особенно трудно, доза разводки в ее питательной среде может обеспечить засев всего 10 л вина, предварительно приведенного, если необходимо, к рН 3,3 и к температуре 18— 20°С. Когда яблочно-молочное брожение пойдет нормально, эти 10 л можно использовать для обсеменения от 50 до 100 л этого же вина; затем можно засеять от 500 до 1000 л, потом 10 000 л и т. д. На каждой стадии нужно тщательно проверять исчезновение яблочной кислоты. Разумеется, что эшелонирование объемов может изменяться и должно производиться с учетом трудностей реализации яблочно-молочного брожения.
Как указывает Ардэн (1972), результат получается не всегда положительным. Существуют вина, в которых сбраживание яблочной кислоты не происходит независимо от условий брожения. Использование ферментов яблочно-молочного брожения по этой методике никогда не приводило к неудачам. Встречающиеся трудности, несомненно, связаны с условиями приготовления разводок. Можно опасаться, что лиофилизация клеток ведет к потере некоторой активности, которая может изменяться в зависимости от технологии и условий сушки. К тому же критерии селекции бактерий, используемых для разводки, и условия приготовления ее, имея в виду адаптацию бактерий к размножению в вине, еще окончательно не разработаны.

Приготовление разводки бактерий.

Приготовление таких разводок не входит в обязанности винодела. Однако этот вопрос имеет решающее значение и в большой степени определяет успех или неудачу операции.
Он затрагивает три проблемы: выбор расы бактерий, условия ее предварительной культуры, условия поставки разводки потребителю.
Отобранный штамм бактерий должен обладать способностью развиваться в вине, т. е. при относительно малом рН и в присутствии спирта. Латентный период не должен быть слишком большим, а рост должен начаться до того, как регрессия приведет к полному исчезновению популяции. Когда обсеменение проводят после израсходования сбраживаемых сахаров, гомо- или гетероферментативный признак не имеет более решающего значения, поскольку он относится исключительно к использованию глюкозы и фруктозы. Возможность разложения пентоз или лимонной кислоты является более важным критерием, и было бы интересно отобрать штаммы, которые их не разлагают, так как это разложение всегда сопровождается образованием уксусной кислоты. В равной степени такой штамм не должен образовывать гистамина. Наконец, после обнаружения в вине трегалозы (Бертран и сотрудники, 1975) следует считаться с возможным разложением этого дисахарида молочнокислыми бактериями. Все эти условия имеют частично противоречивый характер, и пока что нельзя сказать, что найдено действительно удовлетворительное решение.
Кроме того, независимо от природы расы условия ее предварительной культуры с целью получить разводку в собственном смысле слова способны оказывать влияние на возможность роста бактерий в вине, например адаптация в спиртсодержащей среде. Эти условия также подразумевают способность штамма разлагать яблочную кислоту, что возможно в некоторых случаях, но только если среда предкультуры сама содержит яблочную кислоту.
Наконец, обсеменение вина следует производить достаточно большим числом бактерий, примерно 10⁶ клеток на 1 см³. Поэтому нужно, чтобы разводка поступала на места ее использования в достаточно компактном виде. Добавление бактерий с их средой предкультуры или в виде центрифугатов таких сред можно практиковать только при производстве вин в малых объемах. Единственный способ, применяемый при больших объемах вин, состоит в том, что бактерии сначала готовят, а затем сохраняют в виде порошка или высококонцентрированных гранул, которые направляют на винзаводы. Это можно делать путем лиофилизации (сублимационная, вакуумная сушка), но при этом отмечали значительную потерю активности и большое число отмерших клеток. Можно надеяться на лучшие результаты при использовании новых способов, которые заключаются в том, что культуру сушат при низкой температуре в присутствии глицерина, действующего в качестве защитной среды.