Биология молочнокислых бактерий - Экология и систематика молочнокислых бактерий

Выделение из вин и классификация молочнокислых бактерий выполнены во многих винодельческих районах мира. Основной вклад в изучение молочнокислых бактерий вина внесли французские исследователи: Пейно Э., Риберо-Гайон Ж., Лафон-Лафуркад С., Домерк С., Сюдро Р. и др., исследования которых обобщены Риберо-Гайоном Ж. и соавт. [74]. Молочнокислые бактерии вина изучали Ранкин Б. и Форначон Ж. [173] в винах Австралии, Росси И., Костамагна Л., Клементи Ф. [178] - в Италии, Марэ Р. и Соцци [151,152] - в Швейцарии, Ингрэхэм Ж., Вогн Р., Кук Г. [135], Райс А. [175] - в Америке, Чэлфэн Ж., Гольдберг И., Мателс Р. [104] - в Израиле. В результате установлено, что в зависимости от климатических условий и типа вин с преобладанием гомо-  или гетероферментативной группы выделяются представители родов: Lactobacillus, Lenconostoc, Pediococcus. Источником молочнокислых бактерий в вине являются виноград, заводское оборудование и коммуникации.
В нашей стране этому вопросу уделялось значительно меньше внимания. Обстоятельные исследования по экологии МКБ принадлежат Квасникову Е.И. и его ученикам [41,43]. Квасниковым Е.И., Кондо Г.Ф. [42] установлено, что наибольшую угрозу виноделию Средней Азии представляют молочнокислые бактерии. При изучении штаммов, выделенных из вин Средней Азии и Казахстана, в сопоставлении со штаммами, выделенными из различных природных субстратов, установлена их идентичность.
В винах Молдавии определение видового состава молочнокислых бактерий проведено Юстратовой Л.С. [32]. Автор указывает, что в этом регионе наиболее часто выделяются гомоферментативные палочки, затем гетероферментативные палочки, тогда как гетероферментативные кокки не встречаются. Однако, в работах Кондо Г.Ф. [47] отмечается частое присутствие гетероферментативных кокков в винах Молдавии.
Выделение в чистую культуру и таксономическое определение молочнокислых бактерий из армянских вин осуществлено Петян Э.О. [65] и Авакяном Б.П. [1].
Рабинович З.Д. и Бурьян Н.И. [70] определили видовой состав молочнокислых бактерий в винах Крыма, Гянджинского района Азербайджана, Одесской области. Выделенные штаммы принадлежали к гомоферментативным палочкам Lact.  plantarum, коккам Pediococcus cerevisiae, гетероферментативным палочкам Lact. brevis и Lact buchneri, коккам Leuconostos gracile и Leuc. oenos. Из работ, посвящённых экологии молочнокислых бактерий в отдельных винодельческих районах СНГ, надо отметить исследования Гогоберидзе Р.Г. [10] грузинских вин и Журавлёвой В.П. с соавт. [35] туркменских вин. Ивановой И.П. и Баштанной И.И. [38] при изучении молочнокислых бактерий в производстве шампанского бутылочным методом из 302 образцов готовой продукции и производственных объектов выделено 100 штаммов чистых культур молочнокислых бактерий, представленных, в основном, гомоферментативными кокками (38 шт.) рода Streptococcus, гомоферментативными палочками (27 шт.) рода Lactobacillus подрода Streptobacterium, а также в небольшом количестве гетерококками (3 шт.) рода Leuconostoc и гетероферментативными палочками (4 шт.) рода Lactobacillus подрода Betabacterium. Показано, что концентрация этанола и диоксида серы, принятые в шампанском производстве, не ограничивают развитие молочнокислых бактерий.
Молочнокислые бактерии в испанских винах при их приготовлении и хранении описаны Пардо Зунига [162].
Классификация молочнокислых бактерий очень трудна, что связано с некоторыми особенностями этой группы микроорганизмов. Во-первых, молочнокислые бактерии очень широко распространены в природе в разнообразных местах обитания. Нередко обнаруживаются молочнокислые бактерии, отдельные признаки которых не характерны для всей группы. Во-вторых, трудность классификации заключается в широкой изменчивости многих свойств этих микроорганизмов, особенно при культивировании их на разных средах и в разных условиях. Среди молочнокислых бактерий часто обнаруживаются штаммы, которые не могут быть отнесены к тому или иному виду или подроду, а занимают как бы промежуточное положение.
Подробный анализ имеющихся схем классификации молочнокислых бактерий проведен Квасниковым Е.И. и Нестеренко О.А. [43], Риберо-Гайоном Ж. с соавт. [74], Бурьян Н.И. [5,6]. В целом в систематике бактерий так мало внимания уделено молочнокислым бактериям, что трудно найти место для молочнокислых бактерий вина.
Молочнокислые бактерии, выделяемые из вин, отличаются от МКБ других мест обитания способностью размножаться при низких значениях pH (2,6-3,2) в присутствии спирта и в среде, достаточно бедной питательными веществами.
Пейно Э. и Домерк С. [166] отмечают, что установить классификацию бактерий вина на основе систематики бактерий другого происхождения невозможно. Педерсон С. [164] выделил молочнокислые бактерии вина в отдельную группу, назвав "неактивными бактериями" из-за их чрезвычайно медленного роста даже на средах, богатых питательными веществами.
Работы по классификации бактерий, выделенных из вина, довольно многочисленны, однако они не всегда основаны на большом количестве штаммов. Пейно Э., Домерк С. [166] на 400 штаммах проанализировали имеющиеся частные схемы классификации и оценили весомость используемых в них признаков. Предлагаемая ими классификация использует схемы Вогна Р. и соавт. по гетеропалочкам [74], Рогозы М. и соавт. [177], Рогозы М. и Шарп М. [176] по гомопалочкам, Гарвей Е. [122,123] по лейконостокам и Накагавы А. и Китахара К. [74] по педиококкам и основывается, прежде всего, на морфологии клеток (палочки или кокки), характере брожения глюкозы (гомо- или гетеро-) и на брожении пентоз - свойстве, которое, по мнению Пейно, имеет особое энологическое значение.
В таблице 1.1. приводится классификация молочнокислых бактерий вина на основании пентозного теста и сбраживания лимонной кислоты [74]. По экологической классификации имеется две разновидности Lact. plantarum: гомоферментативные бактерии, сбраживающие пентозы и разлагающие лимонную кислоту, и бактерии, разлагающие лимонную кислоту и не сбраживающие пентоз. Такая характеристика бактериальных видов удобна для практического виноделия.
Распределение кокков и палочек по функциям сбраживания пентоз явилось неожиданным и заслуживает особого внимания. Оказалось, что кокки могут быть чаще всего пентозонегативными или арабинозоположительными. Кокки, которые сбраживают ксилозу, в вине чрезвычайно редки. Ещё более редки палочки, которые сбраживают арабинозу. Также немногочисленны кокки, которые сбраживают обе пентозы, и палочки, которые не сбраживают никакую. Противоположность поведения кокков и бацилл по отношению к сбраживанию пентоз выражает параллелизм, который существует между формой клетки и некоторыми функциями брожения.

Таблица 1.1
Классификация молочнокислых бактерий вин по [74]

Сбраживают: А+ арабинозу; Х+ ксилозу; Р+ пентозы (арабинозу, ксилозу), С+ лимонную кислоту.
Не сбраживают: Р+ пентозы (арабинозу, ксилозу); С- лимонную кислоту.

Следует отметить, что ещё в первой классификации Орла-Иенсена С. [161] брожение арабинозы и ксилозы служило критерием для идентификации лактобацилл. Брожение гексоз палочками часто слабо выражено и проявляет от одного штамма к другому все степени ферментативной активности. Напротив, пентозы сбраживаются легче и по этому признаку молочнокислые бактерии вина легко классифицируются.
Пентозный тест является основой для дифференциации по многим соображениям. Во-первых, он унифицирует базу классификации палочек и кокков. Во-вторых, сбраживание пентоз бактериями является единственной ярко выраженной чертой сбраживания, поскольку она стабильна и не адаптивна. Наконец, возможность трансформировать пентозы имеет технологический интерес, потому что она является мерой опасности бактериальных изменений. Однако, ценность пентозного теста не исключает необходимости изучения других свойств описываемых молочнокислых бактерий.
В системе мероприятий по биологической стабилизации вин важное место занимает создание условий для своевременного прохождения яблочно-молочного брожения в высококислотных материалах и предотвращения молочнокислых процессов в других типах вин. Для разработки рекомендаций по регулированию кислотности вин большое значение имеют данные по экологии молочнокислых бактерий.
В период с 1972 по 1990 гг. на наличие молочнокислых бактерий нами было обследовано большое количество виноматериалов различных регионов Советского Союза. В чистые линии выделены молочнокислые бактерии всех систематических групп (табл. 1,2). Как видно, самыми редкими в молочнокислой микрофлоре обследованных вин являются представители рода Pediococcus. Они встретились только однажды и проявили пониженную жизнеспособность при хранении, погибнув уже при первых пересевах.
Несколько чаще, но тоже относительно редко, встречаются в изученных винах гомоферментативные палочки. Основным источником их выделения были образцы хересуемого виноматериала из-под плёнки. Выделение из хереса молочнокислых бактерий оказалось чрезвычайно трудным, несмотря на практически постоянное их присутствие в процессе хересования. Выделенные гомопалочки были нежизнеспособны при хранении и быстро погибали в лабораторных условиях.
Наиболее частыми представителями молочнокислой микрофлоры в виноматериалах обследованных регионов являются гетероферментативные палочки и кокки. При этом прослеживается совершенно чёткая связь между характером выделяемой микрофлоры, типом виноматериала и климатическим регионом.
Этот тезис можно проследить на виноматериалах Киргизии, весьма контрастной в климатическом отношении. Из виноматериалов различных типов было выделено около 700 чистых линий МКБ. При определении их принадлежности к биохимической группе все они оказались гетероферментативными [21].
Для идентификации были отобраны 139 штаммов, отличающихся по морфологии. Анализ морфолого-культуральных особенностей изученных молочнокислых бактерий позволил выделить 4 группы (табл. 1.3). Как видно из представленных данных, большим разнообразием отличалась морфология колоний. Интересным кажется выделение очень мелких тонких палочек, часто образующих длинные нити и скопления и дающих слабый рост на жидкой среде.
Все бактерии были неподвижны и не способны к спорообразованию, росли при 15°С и не давали роста при 45°С.
Изучение биохимических свойств позволило определить видовой состав изученных молочнокислых бактерий (табл.1.4).

Таблица 1.2
Молочнокислая микрофлора различных виноматериалов

 
Таблица 1.3
Морфолого-культуральные свойства молочнокислых бактерий

Представленный материал указывает на подавляющее преобладание гетероферментативных палочек в микрофлоре киргизских вин, причём палочек, различных по морфологии. Наибольшим разнообразием отличались молочнокислые бактерии яблочных соков. Интерес представляло выделение бактерий вида Lact. hilgardii. В отечественной литературе мы не встречали сведений об обнаружении этого вида молочнокислых бактерий в вине, хотя зарубежные исследователи считают его обычным для плодово-ягодных и виноградных вин. Lact. hilgardii в большом количестве выделяются с винограда и чаще из больных вин, чем из вин с яблочно-молочным брожением. Однако этот вид считают хорошим проводником яблочно-молочного брожения, так как яблочная кислота сбраживается им при pH 3,0-3,2. 

Таблица 1.4
Видовой состав молочнокислой микрофлоры вин Киргизии по [166]

Обозначения: X+ ксилозоположительные;
р+ пентозоположительные.

Присутствие этих бактерий в столовых виноградных материалах, а также гетероферментативных кокков рода Leuconostoc свидетельствует о потенциальной возможности осуществления спонтанного биологического кислотопонижения вин и создаёт предпосылки для регулирования их кислотности.
Lact. brevis и Lact. buchneri - технологически самые нежелательные виды. Они выделяются почти всегда из больных вин. Хорошая сопротивляемость спирту и кислотности, способность утилизировать пентозы позволяет развиваться этим бактериям в винах с пониженным содержанием гексоз.

Выделение большого количества указанных бактерий должно настораживать и требует тщательного микробиологического контроля на всех стадиях приготовления вина.
Систематическое положение определяли и у 33 штаммов рода Leuconostoc, выделенных из анапских и киргизских вин (табл. 1.5). При идентификации особое внимание уделялось сбраживанию пентоз. Учитывалась также характерная особенность бактерий рода Leuconostos - их неспособность образовывать аммиак из аргинина [166].
Из 33 штаммов только 2 были отнесены к виду Leuconostoc oenos, остальные 31 штамм к виду Leuconostoc mesenteroides var. gracile.
Все культуры в большей или в меньшей степени, в зависимости от интенсивности роста, были способны к образованию СО2 из глюкозы.
Полученные нами результаты вполне согласуются с мнением большинства исследователей о преимущественном преобладании гетероферментативных форм молочнокислых бактерий в винах, изготавливаемых в регионах с жарким климатом.

Таблица 1.5
Видовой состав молочнокислых бактерий рода Leuconostoc

Условные обозначения: + наличие признака;
- отсутствие признака