Биология молочнокислых бактерий - Особенности развития молочнокислых бактерий в процессе яблочно-молочного брожения

Из всех процессов, вызываемых в вине молочнокислыми бактериями, полезным является только разложение яблочной кислоты в высококислотных винах. Разложение других компонентов приводит к нежелательным изменениям вина и является безусловно вредным. Разложение яблочной кислоты, называемое яблочно-молочным брожением, играет значительную роль и в производстве игристых вин.
Имеется обширная литература по механизму этого процесса, который до сих пор нельзя считать до конца установленным. Суть его сводится к превращению яблочной кислоты в молочную с помощью ряда ферментов, некоторые из которых являются адаптивными и проявляются бактериями при наличии яблочной кислоты. Риберо-Гайон Ж. [74], Радлер Ф. [172] показали, что для разложения 1 г яблочной кислоты бактериями необходимо 0,1-0,2 г глюкозы в качестве источника энергии.
Многочисленные исследования [1, 65, 70, 74, 90, 92, 146, 147, 166] показали, что из вин подвергавшихся яблоч- но-молочному брожению, изолируются различные виды молочнокислых бактерий, как гомоферментативных (Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei), так и гетеро- ферментативных (Lact. buchneri, Lact. brevis, Lact. hilgardii, Leuconostos mesenteroides, Leuconostoc citrovorum, Leuconostoc vini, Leuconostoc gracile).
Считается общепризнанным, что яблочно-молочное брожение в вине может быть вызвано любым видом молочнокислых бактерий. Однако, для качества вина этот вопрос имеет особое значение. Предпочтение следует отдавать бактериям, которые при разложении яблочной кислоты не затрагивают другие компоненты вина и поэтому не накапливают или накапливают в минимальных количествах побочные продукты.
С этой точки зрения наиболее благоприятными агентами кислотопонижения являются гомоферментативные палочки Lactobacillus plantarum и гетероферментативные кокки рода Leuconostoc.

Яблочно-молочное брожение в винах с “зелёной” кислотностью значительно улучшает вкус, делая его мягким и гармоничным. Кроме того, яблочная кислота в вине в количестве более 2 г/дм³ является фактором биологической дестабилизации. Поэтому, при приготовлении столовых и шампанских виноматериалов прохождение яблочно-молочного брожения является весьма желательным с точки зрения повышения их качества и биологической стабильности.
При благоприятных условиях процесс яблочно-молочного брожения довольно легко проходит спонтанно, благодаря естественной молочнокислой микрофлоре.
Риберо-Гайон Ж. и соавторы [74], обобщив многочисленные сведения о разложения кислоты в винах, указывают, что уже в начале века яблочно-молочное брожение рассматривали как обычное явление в виноделии. По мнению авторов, без яблочно-молочного брожения не было бы выдающихся бордоских вин, исходя из этого, они обосновали необходимость не препятствовать этому процессу при приготовлении тонких высококачественных вин.
Для ординарных вин массового потребления яблочно- молочное брожение представляет собой ещё один элемент стабильности и часто значительного улучшения качества.
Необходимость яблочно-молочного брожения для повышения качества и стабильности вин подчёркивает в своём обзоре Гнаеджи Ф. [125], утверждавший, что получение стабильного вина высокого качества требует, чтобы за спиртовым брожением как можно скорее проходило яблочно-молочное брожение.
Соцци Т. и соавт. [189], обобщая сведения о яблочно- молочном брожении, указывают на то, что вина, претерпевшие ЯМБ, вследствие большей стабильности требуют значительно меньшее количество диоксида серы для предупреждения развития микроорганизмов. Авторы сообщают также о существующей в некоторых странах с жарким климатом, таких как Австралия, практике добавления в сусло винной и яблочной кислот для понижения значения pH до 3,2- 3,5, способствуя тем самым яблочно-молочному брожению для получения высококачественных вин типа шампанского, а также вин Бордо, Мерло и др.
Минарик Э. [158] утверждает, что не требует доказательства тот факт, что яблочно-молочное брожение в относительно северных винодельческих странах - Швейцария, Чехословакия, Германия - является чрезвычайно важным биологическим процессом, влияющим на формирование качества вина.
Проведение биологического кислотопонижения путём введения в вино культуры молочнокислых бактерий связан с определёнными трудностями.
Размножение инокулированных в вино молочнокислых бактерий затрудняет довольно ограниченный набор питательных компонентов, в особенности азотистых веществ. Большое значение имеет соотношение винной и яблочной кислот и его pH. Чем выше содержание яблочной кислоты, тем легче индуцируется процесс ЯМБ.
Брешо К. показано, что при содержании яблочной кислоты больше 40 ммоль яблочно-молочное брожение начинается после спиртового брожения и частично проходит параллельно со спиртовым брожением, если яблочной кислоты меньше 40 ммоль.
Решающее влияние pH на развитие яблочно-молочного брожения отмечено в работах Михеля М. [157], Бусбура, Кунке Р. [100], Манка де Награ М., Страссер де Саад А. [150], Рабинович З.Д. [69,68], Гробман М. [128], Рунжик- Перик В. [179]. Скорость брожения была прямо пропорциональна первоначальным значениям pH. Этим авторы объясняют более лёгкое прохождение яблочно-молочного брожения в красных винах, поскольку фенольные вещества снижают ОВ-потенциал.
В крупных резервуарах яблочно-молочное брожение проходит легче, чем в мелкой таре, что связывают с длительным сохранением благоприятной для развития молочнокислых бактерий температуры [47,49].
Важным моментом проведения индуцированного яблочно-молочного брожения является вопрос о периоде внесения бактериальной культуры. Многие авторы считают нецелесообразным проведение кислотопонижения в присутствии сахаров из-за риска нежелательных процессов [134].
Однако, в сообщениях Пейно Э., Домерк С. [165], Галзи П., План С. [121], Голландеса Ж. [120], Вебба Р. и Ингрэхэма Ж. [196] убедительно показано, что при внесении молочнокислых бактерий до окончания спиртового брожения шансы на успешное прохождение яблочно-молочного брожения значительно возрастают.
Как известно, непрерывное культивирование микроорганизмов явилось основой усовершенствования многих технологических процессов. Технология биологического кислотопонижения виноматериалов в непрерывном потоке разработана Орешкиной А.Е., Саришвили Н.Г., Трофимченко А.В. [3]. Сущность способа заключается в комплексном использовании дрожжей и молочнокислых бактерий, что даёт возможность вести биологическое кислотопонижение и регулировать окислительно-восстановительные процессы при производстве столовых вин. Промышленная установка сконструирована в НПО "Яловены" [45,46], на Одесском заводе шампанских вин [85].
Имеются сообщения об опыте использования сухих культур молочнокислых бактерий для проведения яблочно-молочного брожения [7,40], однако он не доведен до промышленного внедрения.
В последние годы много внимания уделяется анализу возможности использования для биологического кислотопонижения иммобилизованных микроорганизмов. Отработаны режимы иммобилизации молочнокислых бактерий в гелях альгината и каррагината, изучены условия проведения яблочно-молочного брожения иммобилизованными бактериями. Показана перспективность данного направления исследований [56, 114, 115].
Гнаеджи и соавт. [126,127], испытав различные опытные и коммерческие препараты бактерий яблочно-молочного брожения, пришли к выводу об их ненадёжности вследствие низкой жизнеспособности бактерий и отсутствии активности в вине. Кроме того, авторы рекомендуют использование нескольких штаммов молочнокислых бактерий одновременно или друг за другом в связи с обнаруженным явлением лизиса бактерий в процессе яблочно-молочного брожения специфическими бактериофагами [189,190].
Источником молочнокислых бактерий в шампанском производстве являются, в основном, поступающие виноматериалы. Благодаря своим малым размерам (0,5-0,6 мкм) бактерии попадают в тиражную смесь после контрольной фильтрации купажа (за исключением обеспложивающей фильтрации). Присутствие молочнокислых бактерий при шампанизации и послетиражной выдержке резко ухудшает структуру осадка. Разложение же яблочной кислоты при этом играет значительную роль в сложении качества готового шампанского.
К сожалению, сведения о значении яблочно-молочного брожения в шампанском производстве крайне ограничены и противоречивы. Родопуло А.К. [75,76] на основании изучения превращения органических кислот в процессе приготовления виноматериалов и шампанизации считал целесообразным снижение содержания яблочной кислоты. Пиерра Ж. [169] при изучении яблочно-молочного брожения в винах Шампани отмечал, что в шампанских виноматериалах процесс этот не всегда желателен из-за риска конкуренции бактерий с дрожжами при шампанизации. Поэтому при получении шампанских виноматериалов стремятся к завершению яблочно-молочного брожения до вторичного брожения.
Цаков Д. и Спиров Н. [86] при исследовании влияния яблочно-молочного брожения на качество шампанского отметили, что яблочная кислота повышает вкусовые качества шампанских виноматериалов и улучшает шампанские, т.е. пенистые и игристые свойства. Однако авторы не определяют каких-либо количественных границ в содержании яблочной кислоты и указывают на необходимость тщательного анализа при оценке целесообразности проведения яблочно-молочного брожения.
Павлов Д. [62] в обзоре положительных и отрицательных сторон яблочно-молочного брожения подчеркнул, что вопрос о его целесообразности решается не шаблонно, а исходя из количественного соотношения винной и яблочной кислот в вине, и сочетании с другими аналитическими показателями.
Цветанов О. и Бамбалов Г. [88,89] при изучении влияния яблочно-молочного брожения на качество красных игристых вин указывают, что наиболее высококачественные вина с кондициями "полусухое" получают из виноматериалов, где не проходило яблочно-молочное брожение, тогда как вина с кондициями "брют" можно получать из виноматериала сорта Каберне-Совиньон с прошедшим кислотопонижением.
Процесс яблочно-молочного брожения не сводится к простому уменьшению количества яблочной кислоты.
Зинченко В.И. [37], придавая важное значение водорастворимым полисахаридам в формировании мягкого вкуса вина, исследовал влияние яблочно-молочного брожения на изменение полисахаридов в белых столовых винах. Им показано, что молочнокислые бактерии в процессе яблочно-молочного брожения способствуют заметному обогащению вина полисахаридами бактериального происхождения, сложными углевод- и азотсодержащими соединениями (гликопротеинами с преобладанием в углеводном составе моносахаридов галактозы, арабинозы и частично уроновых кислот). Поэтому яблочно-молочное брожение является весьма эффективным технологическим приёмом для получения достаточно экстрактивных белых столовых вин с мягким гармоничным вкусом. Однако, поскольку накопление углевод-белковых соединений может вызвать помутнение коллоидного характера, предложено обработку столовых виноматериалов проводить после завершения яблочно-молочного брожения [39].
Изучение ароматических веществ вина с прошедшим биологическим кислотопонижением 1156] показало, что в 70- 100% случаев яблочно-молочное брожение вызывает повышение концентрации следующих веществ: н-бутилового эфира уксусной кислоты, 3-гидрокси-2-бутанола, этилового эфира молочной кислоты, этилового эфира н-октановой кислоты, 2- октанола, изопентилового эфира молочной кислоты, метилового эфира н-декановой кислоты, фенил-этилового эфира гексановой кислоты.

Показано увеличение интенсивности окраски молодого красного вина после яблочно-молочного брожения на 20-80% по сравнению с контролем. Объясняется это тем, что в процессе яблочно-молочного брожения в результате конденсации, адсорбции и окисления сформировались стабильные и интенсивно-окрашенные комплексы окрашивающих веществ [174]. Эта взаимосвязь подтвердилась снижением содержания свободных антоцианов и увеличением степени конденсации в опытных винах в отличие от контрольных.
Дитрих X. и соавт. [113] при изучении влияния яблочно-молочного брожения на химический состав молодых вин установили увеличение концентрации D-лактата, этилового эфира молочной кислоты, уксусной кислоты, акролеина, приведенного экстракта, глюконовой кислоты и иногда глицерина. Концентрация высших спиртов (С3 - С5) была приблизительно одинаковой.
Таким образом, представленные данные литературы убедительно показывают неослабевающий интерес к молочнокислым бактериям вина в контексте решения проблемы регулирования кислотности вин. Однако, несмотря на многочисленные исследования в этом направлении, нерешённым остаётся вопрос о надёжности и гарантированности проведения индуцированного яблочно-молочного брожения путём скрининга активных штаммов-кислотопонижателей и создания условий для биологического кислотопонижения за счёт естественной молочнокислой микрофлоры. Кроме того, совершенно очевидно, что в отечественном виноделии этому вопросу уделялось мало внимания, что сдерживает введение в практику яблочно-молочного брожения, являющегося важнейшим фактором повышения качества и стабильности виноматериалов и вин.
Изучение особенностей развития молочнокислых бактерий для индуцирования яблочно-молочного брожения предполагает прежде всего оптимизацию условий культивирования этих микроорганизмов, отличающихся достаточно высокими питательными потребностями.
С целью выбора оптимальной среды для накопления биомассы молочнокислых бактерий рода Leuconostoc при приготовлении разводки чистой культуры нами изучены натуральные среды (табл. 3.1). Учёт бактерий вели по интенсивности мутности, замеряемой на фотоэлектрокалориметре с последующим пересчётом на количество клеток в 1 см³.
Для проведения процесса был избран температурный режим 37°С, поскольку в некоторых руководствах он рекомендуется для быстрого размножения молочнокислых бактерий. Перемешивание осуществляли каждые 3 часа, создавая условия умеренной аэрации.
Анализ представленных данных убедительно показывает целесообразность аэрации при культивировании молочнокислых бактерий рода Leuconostoc. Оптимальным для накопления биомассы оказался температурный режим 26-28°С. Лучшими питательными средами явились смесь солодового сусла с виноградным и солодовое сусло с яблочной кислотой.
Такой режим и питательная среда рекомендованы для приготовления разводки молочнокислых бактерий в производственных условиях для проведения процесса яблочно-молочного брожения.
Таблица 3.1
Интенсивность роста молочнокислых бактерий на различных питательных средах