Биология молочнокислых бактерий - Лизогения молочнокислых бактерий вина

Лизогения представляет собой одно из самых замечательных явлений в биологии микроорганизмов и в бактериофагии и является своеобразным генетическим симбиозом, при котором генетический материал фага переходит в латентное состояние, внедряется в генетический аппарат бактерии хозяина и таким образом превращается в часть хромосомы и ведёт себя как бактериальный ген, хотя физически представляет структуру, включающую большое количество генов. В результате лизогенизации клетка приобретает наследственную способность продуцировать фаг без предварительного инфицирования её данным фагом.
В последние годы лизогения выявлена почти у всех групп микроорганизмов. Такое широкое её распространение даёт основание считать это явление нормальным состоянием микробной клетки на данном этапе её эволюции [73].
Изучение явления бактериофагии в технологических процессах показало, что источником бактериофагов на производстве обычно являются лизогенные культуры. Сведений о лизогении молочнокислых бактерий относительно мало, и касаются они, в основном, молочной промышленности. Первое сообщение о лизогении Str. cremoris находим у Яковлева Д.А. [93], выделившего фаг из чистой музейной культуры.
По данным Палладиной О.К. с соавт. [63], лизогенные культуры молочнокислых стрептококков встречаются крайне редко.
Райтер П. [71] показал, что источником фага в молочнокислой закваске явились лизогенные культуры.
Анализ литературы показывает, что сведения о лизогении молочнокислых бактерий весьма противоречивы. Наряду с сообщениями о выявлении лизогенных культур среди различных видов молочнокислых бактерий [33, 106, 137, 183 и др.] есть данные и о неудачных попытках обнаружения этого явления [53, 118 и др.]. Многие исследователи отмечают, что обнаружить лизогенные штаммы в роде Lactobacillus очень трудно [182]. Обращает на себя внимание и тот факт, что большинство из описанных в последнее время умеренных фагов лактобактерий оказались дефектными, то есть неспособными давать негативные колонии или зоны лизиса.
Так, Киог Б. и Шиммин П. [137] выявили фагоподобные частицы с бактериоциноподобной активностью при УФ-облучении Str. cremoris.
Клерк X. и Гюго Н. [140] при индукции митомицином Lactobacillus обнаружили ингибирующую активность, связанную с дефектными фагами.
Сакурай Тошизо и соавт. [181] при исследовании 110 штаммов Lactobacillus выявили 3 лизогенных штамма L. salivarius и 1 штамм L. casei. Однако ни ингибирующей активностью, ни способностью формировать негативные колонии выявленные фаги не обладали.
Токияма Киоши и соавт. [195] из 30 изученных на лизогению штаммов L. salivarius обнаружили лизис 23 штаммов после индукции митомицином С. Во всех лизатах были обнаружены фагоподобные частицы, однако только 2 были способны образовывать точечные негативные колонии, 6 фагов давали лишь зоны угнетения без репродукции пятнообразующих частиц. Лизаты 15 штаммов не имели ни способности угнетать рост бактерий, ни формировать негативные колонии. О выделении умеренных фагов после индукции молочнокислых бактерий сообщают Козак В. с соавт. [141], Мак Кэй и Болдуин К. [155], Лаури Р. [149], Тараканов Б. [81], Мытник А. и соавт. [57].
Для получения более чётких данных о лизогении у молочнокислых бактерий необходимо тщательное изучение этого явления у разных видов данной группы микроорганизмов с применением современных методов исследования, включая электронную микроскопию. Изучение лизогенного состояния у молочнокислых бактерий, обитающих в вине, расширит представления о биологии молочнокислых бактерий и роли этого явления в процессах виноделия. Единственное сообщение о лизогении бактерий Leuconostoc oenos, используемых при яблочно-молочном брожении, сделано Кавин Ж. и соавт. [102]. Лизогения выявлена при индукции митомицином С.
Нами при изучении на лизогению 48 штаммов гомоферментативных молочнокислых бактерий вида Lact. plantarum спонтанная фагопродукция выявлена у 2 штаммов. Фильтрат культуральной жидкости штамма К-12-13 обнаружил активность против 13 культур из 19 испытанных в виде просветления чувствительной культуры или её агглютинации. Пассирование фильтрата на чувствительной культуре приводило к накоплению фага и после 5-6 пассажей наблюдался полный лизис. И только в таком активном фильтрате фаг удавалось обнаружить методом агаровых слоёв.
Эти наблюдения согласуются с данными литературы [93, 78, 9, 58] о способности фагов молочнокислых бактерий, помимо лизиса вызывать явление агглютинации. При высокой концентрации фага агглютинация предшествует лизису культуры, при низких концентрациях действие фага на культуру ограничивается её агглютинацией.
Спонтанная продукция фага по выявлению негативных колоний на газоне культуры-хозяина обнаружена у штамма К-210-5. Многократное пассирование культуры приводило к увеличению количества спонтанного фага. Максимальная фагопродукция наблюдалась через 17-20 часов с момента посева, то есть в начале логарифмической фазы роста, затем количество фага уменьшалось и через 40-45 часов фаг не обнаруживался.
Индуцированная фагопродукция изучена у 47 штаммов Lact. plantarum. Методом перекрёстного испытания культур лизогенное состояние выявлено у 43 культур (табл. 5.1). Нами на лизогению исследовано 85 культур рода Lactobacillus, из них
гомоферментативных: Lact, plantarum - 48 штаммов;
гетероферментативных: Lact. brevis - 25 штаммов, Lact. buchneri - 12 штаммов;
гетероферментативных кокков рода Leuconostoc - 15 штаммов.
В качестве индикаторных культур для гомоферментативных молочнокислых бактерий использовали 48 штаммов, для гетероферментативных - 50 штаммов, из них:
Lact. brevis -37 штаммов;
Lact. buchneri - 11 штаммов;                                                                  
Lact. fermenti - 2 штамма.

Использованные в работе культуры получены из коллекции института “Магарач”. Анализ спонтанной фагопродукции осуществляли по принципу Гильдемейстера и Херцберга [124] методом перекрёстного испытания культур на жидкой и плотной питательных средах [72].
Анализ индуцированной фагопродукции проводили по принципу Хейгла и Дельбрюка [12]. В качестве индуцирующего агента использовали УФ-лучи (30 с на расстоянии 40 см, лампа БУФ-30). Культуру в экспоненциальной фазе роста разводили стерильным физраствором в отношении 1:100. Облучали 2 см³ взвеси бактерий в чашке Петри. Лизогенное состояние культур на плотной среде определяли внутриагаровым методом и методом агаровых слоёв по Грациа [12]. Чашки инкубировали при 28°С в течение суток, затем выдерживали при комнатной температуре в течение 5-6 суток. При анализе исследуемых фильтратов на жидкой среде использовали феномен Д’Эрреля: просветление культуральной жидкости под действием фага. 
Таблица 5.1
Результаты изучения лизогении у молочнокислых бактерий Lact. plantarum

Выделение "чистой" линии фага проводили по методике Рапопорта [12].
Следует отметить, что многие из выявленных лизогенных культур не давали устойчивых результатов по индукции фага. Низкая воспроизводимость обнаружена и при работе с полученными лизатами, что может быть связано со слабой вирулентностью фагов.
Таким образом, изучение лизогении молочнокислых бактерий у Lact. plantarum показало, что большинство испытанных культур оказались лизогенными. Это даёт основание полагать, что лизогенное состояние имеет весьма широкое распространение в этой группе микроорганизмов и может служить источником соответствующего фага в природе и в производстве [26].
В результате исследования получены чистые линии 3 фагов, выделенных из гомоферментативных молочнокислых бактерий вида Lact. plantarum. Полученные фаги обозначили символом Lp с номером в виде дроби, числитель которой соответствует номеру культуры, из которой выделен фаг, а знаменатель - номеру индикаторной культуры, на которой фаг получен. Таким образом, фаги представлены в следующем виде: Lp 20/5; Lp 7/6; Lp 16/28.
Анализ индуцированной фагопродукции 37 штаммов гетероферментативных молочнокислых бактерий рода Lactobacillus позволил выявить фаг у 3 штаммов Lact. brevis: А-54-7; К-54-4; К-134-3. Фаги давали мелкие нечёткие негативные колонии с мутным дном от 1 до 2 мм в диаметре.
Многочисленные попытки выявления лизогенного состояния по образованию негативных колоний в этой группе МКБ не дали положительных результатов. На жидкой среде обнаруживались явные признаки угнетения культуры исследуемым фильтратом. Действие угнетающего фактора заметно снижалось от разведения к разведению. Аналогичные результаты были получены при изучении индуцированной фагопродукции 17 штаммов рода Leuconostoc. Только 4 лизата дали негативные колонии при использовании метода агаровых слоёв. Колонии были однотипны по морфологии: мелкие до точечных, мутные. Характерной особенностью изучаемых фагов был длительный период формирования негативных колоний, которые обнаруживались только через 10-13 суток.
На жидкой среде практически все исследуемые лизаты вызывали чёткую реакцию просветления культуральной жидкости. После продолжительных и тщетных попыток выделить и стабилизировать фаги из гетероферментативных молочнокислых бактерий было высказано предположение о возможной дефектной лизогении этих культур. Дефектнолизогенные культуры обычно трудно-индуцируемы и освобождают небольшое количество неполноценных, слабо вирулентных частиц, отличающихся способностью вызывать лизис, но неспособных к размножению, а следовательно и к накоплению. Широкое распространение дефектно-лизогенных культур в различных группах микроорганизмов, а также то обстоятельство, что большинство из описанных в последнее время умеренных фагов лактобацилл оказались дефектными, приводит к выводу, что метод выявления наличия фага по способности формировать негативные колонии оказывается недостаточным. Для получения более чётких сведений о природе ингибирующего фактора необходима электронная микроскопия исследуемых лизатов.
Таким образом, изучение лизогении у гетероферментативных молочнокислых бактерий (палочек и кокков) даёт основание предполагать широкое распространение лизогенного состояния в этой группе микроорганизмов. Основная масса исследованных культур, очевидно, является носителем дефектного фага.