Несмотря на многочисленные исследования биологического кислотопонижения с помощью молочнокислых бактерий процесс индуцированного яблочно-молочного брожения не всегда оказывается успешным. Одной из причин неудач яблочно-молочного брожения является присутствие бактериофагов.
В настоящее время бактериофагия фактически превратилась в самостоятельную область биологии, теоретическое и практическое значение которой выходит далеко за пределы микробиологии. Фаги представляют собой особую группу микроорганизмов: это ультрамикроскопические паразиты бактерий, которые по своим биологическим свойствам приближаются к вирусам животных и растений. Явление бактериофагии широко распространено в природе. Последние научные данные свидетельствуют о том, что везде, где есть микроорганизмы, есть и бактериофаги.
Проблема бактериофагии оказалась весьма актуальной для ряда производств, основанных на использовании жизнедеятельности микроорганизмов, на которых в результате фаголизиса стали наблюдаться серьёзные нарушения технологического процесса.
Выявление наличия фагов к большинству известных групп микроорганизмов вызывает необходимость считаться с явлениями фагии при работе с микроорганизмами.
Что касается виноделия и, в частности, молочнокислых бактерий вина, то вопрос этот имеет не только теоретическое значение как для проблемы фагии, так и для биологии молочнокислых бактерий, но и практический интерес в связи с той ролью, какую играют молочнокислые бактерии в технологическом процессе.
Первое сообщение об обнаружении фагов в вине сделано Соцци Т. и Марэ Р. [191]. В винах на стадии яблочно- молочного брожения обнаружено 3 морфологических типа фагов. Подчёркивается, что все фаги выявлены в материалах, pH которых был ниже 3,5.
Дальнейшие исследования этого вопроса [190, 103, 125] привели авторов к убеждению, что трудности яблочно-молочного брожения вина связаны с атакой молочнокислых бактерий бактериофагами. При этом выделены два вида бактериофагов с различной литической способностью Leuconostoc oenos [190].
Минарик Э. [158] при обследовании молодых вин Швейцарии показал, что присутствие бактериофагов тормозит не только индуцированный внесением чистой культуры молочнокислых бактерий процесс яблочно-молочного брожения, но и кислотопонижение, развивающееся за счёт спонтанной микрофлоры.
Гнаеджи Ф. и соавт. [126], Соцци Т. и Гнаеджи Ф. [189] при широком исследовании роли бактериофагов в процессах виноделия предложен поиск молочнокислых бактерий, резистентных к фагу, и приготовление на их основе стартовых культур для проведения яблочно-молочного брожения.
Оптимизация условий выявления фаголизиса у молочнокислых бактерий вина
Поскольку при работе с фагом первостепенное значение имеет получение хорошего газона культуры на поверхности агаровой пластины и в связи с исключительно слабым ростом молочнокислых бактерий вина на плотных средах, была проведена работа по подбору оптимального состава питательной среды.
Испытанные в качестве стимуляторов 8-оксихинолин (0,0012-0,0020%), ионы натрия (0,025-0,25 М), аммиак (0,0001 М), стрептомицин (0,1-1,5 γ/см3) не оказывали влияния на формирование негативных колоний фага. Считается, что эти вещества благоприятствуют адсорбции фага на бактериальной клетке и его внутриклеточному размножению. Стрептомицин, избирательно действуя на клеточные мембраны, способствует проникновению фага в клетку.
Положительные результаты получены при использовании ионов кальция, которые добавляли в среду в виде хлористого кальция в дозе 0,1 М. Исследование ряда питательных сред для получения газона и выявления фаголизиса на нём привело к выбору мясо-пептонного агара (МПА), который готовился с добавлением хлористого кальция (0,1 М) и дрожжевого экстракта (0,5 %).
Отработка метода освобождения культуральной жидкости от бактерий включала анализ таких приёмов, как центрифугирование, фильтрование через фильтр Зейтца, обработка хлороформом.
В большинстве методик по изучению фаголизиса предлагается центрифугирование при 4000 мин-1 в течение 20-40 мин. Полученные нами данные о стерильности центрифугатов молочнокислых бактерий, полученных при разных условиях, показали неприменимость данного метода. При высеве на агаровые пластинки все центрифугаты давали массу мелких стекловидных колоний. Очевидно это связано с особенностями развития гомоферментативных палочек. Наблюдения молодой культуры отмечали выраженный полиморфизм: культура была представлена длинными тонкими нитями, сильно перевитыми и содержащими массу кокковидных телец на концах нитей и в свободном состоянии. Позже количество кокковых форм заметно снижается. Очевидно, присутствие таких мелких форм и мешает полному осаждению молодой культуры молочнокислых бактерий при центрифугировании.
Из исследований фагов молочнокислых бактерий в молочной промышленности освобождение от бактерий достигается путём фильтрования через фильтр Зейтца. Однако, по многим литературным данным, метод этот не рекомендуется ввиду значительной адсорбции фага фильтром, причём чем ниже концентрация вируса, тем больше его адсорбция, вплоть до полной потери фага.
Выход из положения был найден путём предварительной обработки фильтра мясным бульоном или раствором желатины для насыщения адсорбционной ёмкости фильтра белками [55].
Удобным и быстрым методом освобождения от бактерий является обработка исследуемого субстрата хлороформом [18], но он применим только при работе с фагами, не чувствительными к хлороформу. В связи с отсутствием сведений о чувствительности фагов молочнокислых бактерий к хлороформу, проверить этот метод можно было, лишь получив достаточно активный фаг.
Исследования по влиянию хлороформа на молочнокислые бактерии и их фаги с позиций эффективного освобождения исследуемого субстрата от бактерий показали, что 10- 20-минутная обработка хлороформом полностью убивает бактерии и не действует на фаги. 30-минутная обработка несколько снижает активность фагофильтрата.
Полученные результаты позволили в дальнейшем использовать фильтрование через фильтр Зейтца только при получении фаголизатов с высоким титром. Для освобождения от бактерий исследуемой на присутствие фага жидкости пользовались более простым методом обработки хлороформом.
Работа с фагом предусматривает использование культуры в экспоненциальной фазе роста, для обнаружения которой были построены графики роста двух штаммов гомо- ферментативных палочек Lact. plantarum (К-8-4 и К-12-11). Изученные штаммы отличались по кинетике роста. Логарифмическая фаза наступала через 14-15 часов с момента посева и продолжалась в течение 8 часов у штамма К-8-4 и в течении 4 часов у штамма К-12-11.
Изучение кинетики роста молочнокислых бактерий рода Leuconostoc показало, что экспоненциальная фаза начиналась через 22-24 часа с момента посева и продолжалась до 58-60 часов.
На основании полученных данных в дальнейшей работе использовали культуру рода Lactobacillus в возрасте 18-20 часов, рода Leuconostoc - в возрасте 26-28 часов.
Изучение чувствительности молочнокислых бактерий к УФ-облучению проводили с целью определения оптимальной дозы облучения для выявления индуцированной фагопродукции. УФ-лучи дозировали путём изменения времени экспозиции от 10 с до 1 мин. В литературе оптимальной для индукции фага является доза, при которой погибает половина популяции бактерий. Путём мерного высева взвесей бактерий до и после облучения удалось установить, что оптимальной дозой для исследуемых бактерий можно считать 30 сек.
Опытным путём показано и оптимальное время инкубации облученной взвеси. Оно составило 6-7 часов при температуре 28°С при условии высева на солодовое сусло в отношении 1:100.
