Многочисленными исследованиями отечественных и зарубежных учёных установлено, что наиболее желательными агентами яблочно-молочного брожения являются гетеро- ферментативные кокки, представленные родом Leuconostoc. Предпочтение им отдано по двум причинам. Среди молочнокислых бактерий это самые кислотовыносливые, способные развиваться в вине при pH 2,8. При высокой кислотности гетероферментативные кокки из раствора сахара и яблочной кислоты используют в первую очередь яблочную кислоту. Этим объясняется тот факт, что из вин на стадии яблочно-молочного брожения выделяются обычно бактерии рода Leuconostoc.
Исследования теории и практики биологического кислотопонижения связаны с использованием, главным образом, гетероферментативных кокков. В США для этой цели используется Leuconostoc oenos ML-34 и Leuconostoc oenos PSU-1. Французскими исследователями при изучении индуцированного яблочно-молочного брожения установлено возможное использование гомоферментативных молочнокислых бактерий наряду с гетероферментативными кокками.
В связи с неблагоприятными климатическими условиями в большинстве винодельческих районов СНГ актуальна проблема биологического кислотопонижения, отсюда возникла необходимость подбора культур для проведения яблочно- молочного брожения.
С этой целью нами изучен набор штаммов молочнокислых бактерий рода Leuconostoc, имеющийся в коллекции микроорганизмов ИВиВ "Магарач". Культуры были выделены из виноматериалов Киргизии, Закарпатья, Краснодарского края и Крыма в 1976-1981 годах. Предполагалось определить предельную концентрацию клеток бактерий и время их накопления; изучить влияние питательных сред на концентрацию бактерий; изучить влияние этилового спирта на скорость размножения бактерий и предельную концентрацию клеток бактерий; определить время сбраживания яблочной кислоты в виноградном сусле различными штаммами бактерий при совместном культивировании с дрожжами. Исследования проводили на 44 культурах, одна из которых, под шифром СЛР, состояла из смеси различных штаммов бактерий рода Leuconostoc, и была предложена З.Д. Рабинович в 1971 г. для индуцированного яблочно-молочного брожения. В качестве питательных сред использовали смесь солодового сусла (7% СВ) с яблочным соком в отношении 1:1, pH 3,15 и титруемой кислотностью 6,4 г/дм3 и пастеризованное виноградное сусло с титруемой кислотностью 14,5 г/ дм3. Разводку молочнокислых бактерий культивировали на смеси солодового сусла с яблочным в течение 4 суток. Разводку дрожжей вида Saccharomyces cerevisiae расы Феодосия 1-19 готовили на виноградном сусле в течение 2 суток. Концентрацию клеток бактерий определяли нефелометрически. Об устойчивости бактерий к этанолу судили по их способности развиваться в среде в присутствии спирта. Глубину утилизации яблочной кислоты определяли методом бумажной хроматографии.
Установлено, что максимальная концентрация клеток бактерий на среде из солодового сусла и яблочного сока достигается в течение 3-4 суток. Чётко выделяются штаммы, дающие высокие предельные концентрации клеток (2,9- 4,8408): (48-11-5;101-5;101-11-1,401-1-3; 5-11-4; 5-11-5; 5-11- 8; 5-11-10; А-1-2; А-1-10; А-1-11; А-11-4; 39-2). У некоторых штаммов предельные концентрации не превышали 1,2-2,04-108. Однако высокая концентрация клеток бактерий не коррелировала с периодом их накопления. По этому показателю выделяются другие культуры: 21-2; 39-1; 39-2; ОК-43-2; ОК- 43-3; ОК-43-7; 47-1; 47-2; 47-5; 47-6; 52-1;101-11-2.
Объёмная доля этилового спирта в количестве 5 и 10% задерживает накопление клеток бактерий во времени, однако предельная концентрация их оказывается на уровне контрольной. Отмечены штаммы, мало чувствительные к спирту, у которых задержка роста не отмечалась либо не превышала 1-2 суток (21-1; ОК-43-5; ОК-43-7; 47-1; 47-5; 48-11-5; 52-2; 101-1-1; 101-11-1; 101-11-3; А-1-2; А-1-11; А-11-4). Интересная особенность обнаружена у штаммов: 101-1-2; 101- 1-3 5-1-1; 5-11-2; 5-11-4; 5-115; 5-11-6; 5-11-8; 5-11-9; 5-11-10; СЛР. Их рост стимулировался в присутствии небольших доз этанола, разница во времени достижения предельной концентрации бактерий составляла у некоторых штаммов 3 суток.
На пастеризованном виноградном сусле размножение бактерий было медленным, а концентрация клеток очень низкой и не превышала 0,4-6,04 О7. Кроме того, клетки бактерий были значительно меньших размеров, чем на смеси солодового сусла с яблочным соком.
Таким образом, изучение таких свойств, как предельная концентрация бактерий, период их накопления, влияние этилового спирта на размножение бактерий не позволило выделить по этим показателям определённые культуры. В связи с этим особое внимание было уделено процессу сбраживания яблочной кислоты, который проводили на пастеризованном виноградном сусле при одновременном введении дрожжей и бактерий. В течение 10 суток с момента инокуляции разводки завершилось сбраживание яблочной кислоты штаммами: 39-1; 39-3; 47-5; 52-2; 52-4; 10.1-1-1; 101-1-2; 101-1-3; 101-11-1; 101-11-2; А-1-2; а-1-10; А-1-10; А-1-11. Снижение массовой концентрации титруемых кислот составило 3-4 г/дм3. У 11 культур этот процесс продолжался несколько дольше (14 суток), но у штаммов 101-11-3 и А-11-9 выбраживание яблочной кислоты было наиболее глубоким и снижение кислотности составило 5,4 г/дм3 и 4,5 г/дм3 соответственно. Уменьшение массовой концентрации титруемых кислот различными штаммами было в пределах 2,2-5,4 г/дм3. Были штаммы, которые провели процесс яблочно-молочного брожения только за 43-51 сутки.
Анализ полученных данных показал, что повышенная активность по отношению к яблочной кислоте не коррелировала со скоростью накопления клеток и предельной её концентрацией. Культура СЛР имела средний уровень по предельной концентрации клеток, стимулировалась невысокими дозами этанола, однако оказалась на последнем месте по способности утилизировать яблочную кислоту. Очевидно, потеря активности в отношении яблочной кислоты связана с длительным содержанием культуры в коллекции.
Результаты изучения активности кислотопонижения культурами молочнокислых бактерий рода Leuconostoc, выделенными из виноматериалов Симферополя и ОПБ "Магарач", представлены в табл. 3.3. Использовали пастеризованное виноградное сусло с массовой концентрацией титруемых кислот 9,2 г/дм3 и сахаров 12, 8 г/100 см3.
Показано, что минимальный срок сбраживания яблочной кислоты (7-10 суток) наблюдался у штаммов ОПБ 7-1-6; ОПБ 7-1-2. Основное снижение кислотности проходило в течение первых трёх суток, что подтверждает установленный нами ранее факт сбраживания яблочной кислоты в период логарифмической фазы роста МКБ рода Leuconostoc. Разница в объёмной доле спирта между контролем и опытными образцами объясняется тем, что молочнокислые бактерии в процессе размножения и ЯМБ используют сахар в качестве источника энергии. Низкое содержание спирта в образцах с затянувшимся процессом кислотопонижения объясняется, очевидно, его испарением. Выявлены также различия в питательных потребностях молочнокислых бактерий, в связи с чем качество используемого виноградного сусла в большей степени сказывается на деятельности одних штаммов по сравнению с другими.
Таким образом, в результате проведенной работы отобраны штаммы молочнокислых бактерий рода Leuconostoc, малочувствительные к этанолу и наиболее глубоко и быстро выбраживающие яблочную кислоту. Некоторые из этих штаммов (А-11-9; 101-11-3; А-1-2) во время сезона виноделия 1980 года были испытаны в производственных условиях для проведения индуцированного биологического кислотопонижения на предприятиях Крымсовхозвинпрома (совхоз-завод "Золотая балка", совхоз им. С. Перовской, совхоз-завод "Коктебель" и совхоз "Золотое поле"). Все три культуры дали хорошие результаты, рекомендованы для внедрения в производство и рассылаются по заявкам на заводы первичного виноделия.
Таблица 3.3 Характеристика виноматериалов после яблочно-молочного брожения иа различных штаммах молочнокислых бактерий
Сложность получения большой биомассы гетероферментативных кокков на предприятиях первичного виноделия не исключает возможность использования гомоферментативных палочек, дающих большую биомассу по сравнению с гетероферментативными кокками.
С целью подбора активных кислотопонижателей была проанализирована коллекция гомоферментативных палочек, выделенных нами ранее из виноматериалов различного происхождения. Яблочно-молочное брожение проводили путём введения бактериальной разводки совместно с дрожжевой в пастеризованное виноградное сусло. Разводку бактерий готовили на смеси солодового сусла с яблочным в соотношении 1:1 и использовали двухсуточную в количестве 4%, 2- суточную дрожжевую культуру расы Феодосия 1-19 вносили в количестве 2%. Для исследования использовали пастеризованное виноградное сусло с содержанием, сахаров 13 г/100 см3 и титруемых кислот 11 г/дм3. Помимо 18 штаммов гомоферментативных палочек, в исследование по кислотопонижению были включены для сравнения 2 штамма гетероферментативных кокков рода Leuconostoc (А-П-4 и 101-П- 3), отобранные нами ранее как наиболее активные. Процесс проводили при температуре 27°С.
В табл. 3.4 представлена характеристика виноматериалов после яблочно-молочного брожения на разных штаммах молочнокислых бактерий родов Lactobacillus и Leuconostoc.
По скорости проведения яблочно-молочного брожения выделяются прежде всего гетероферментативные кокки А- П-4 и 101-11-3. На используемом сусле они утилизировали яблочную кислоту в течение 3 суток и завершили процесс кислотопонижения задолго до окончания спиртового брожения. Основное количество штаммов гомоферментативных палочек провели яблочно-молочное брожение за 14-16 суток. 4 штамма завершили процесс только через 21-35 суток, а в образцах с 4 штаммами в течение 40 суток наблюдения снижение кислотности не наблюдалось. Продолжительность яблочно-молочного брожения определялась с момента внесения разводки.
Существенных различий в степени снижения кислотности в виноматериалах при использовании различных штаммов молочнокислых бактерий не обнаружено, оно составляло 2,7-3,1 г/дм3.
Таблица 3.4
Характеристика виноматериалов после биологического кислотопонижения
Штамм | Про- должи- тель- ность ЯМБ, сут. | Массовая концентрация титруемых кислот, г/ дм3 | Снижение кислота, г/дм3 | Массовая концентрация летучих кислот, г/ дм3 | Массовая концентрация органических кислот, г/дм3 | ||
винной | яблочной | молочной | |||||
46-ΙΙΙ-2 | 21 | 7,9 | 3,0 | 0,6 | 4,6 | 1,0 | 2,6 |
А-П-4 | 3 | 7,7 | 3,0 | 0,6 | 4,2 | 1,.4 | 2,4 |
101-ΙΙ-2 | 3 | 7,5 | 3,0 | 0,6 | 3,8 | 1,6 | 2,6 |
46-ΙΙ-4 | яблочно-молочное брожение не прошло | ||||||
46-П-З | 35 | 7,7 | 2,9 | 0,5 | 3,6 | . 1,4 | 1,8 |
0-21-6 | 14 | 8,0 | 2,6 | 0,4 | 3,7 | 2,4 | 1,5 |
46-ΠΙ-4 | 14 | 8,0 | 2,8 | 0,4 | 4,0 | 2,0 | 1,8 |
48-ΙΙ-4 | 16 | 7,8 | 2,9 | 0,4 | 4,1 | 1,2 | 1,6 |
46-1-4 | 21 | 7,8 | 3,1 | 0,4 | 4,5 | 1,4 | 2,4 |
A-IV-10 | 21 | 7,9 | 2,7 | 0,4 | 4,8 | 1,6 | 2,4 |
49-2 | 14 | 7,9 | 2,8 | 0,4 | 3,2 | 1,5 | 2,2 |
49-5 | 35 | 7,9 | 2,7 | 0,5 | 3,8 | 1,5 | 1,6 |
A-1V-II | 16 | 7,9 | 3,1 | 0,6 | 3,8 | 1,2 | 2,6 |
0-21-5 | яблочно-молочное брожение не прошло | ||||||
44-1-2 | яблочно-молочное брожение не прошло | ||||||
46-IV-2 | 18 | 7,9 | 2,8 | 0,5 | 3,7 | 1,1 | 2,0 |
49-1 | 16 | 8,0 | 2,7 | 0,4 | 3,1 | 1,2 | 2,2 |
46-IV-6 | 14 | 7,6 | 2,9 | 0,5 | 3,8 | 1,0 | 2,1 |
К-39-2 | 16 | 8,0 | 2,7 | 0,5 | 4,2 | 0,9 | 1,8 |
44-ΙΙ-4 | яблочно-молочное брожение не прошло | ||||||
42-ΙΙ-4 | 16 | 8,0 | 2,7 | 0,4 | 3,4 | 1,1 | 1,7 |
Исходное сусло | - | 11,3 | - | - | 4,8 | 7,70 | 0,0 |
Яблочная кислота была утилизирована до остаточных количеств. За счёт выпадения винного камня несколько снизилось содержание винной кислоты. Разница в накоплении летучих кислот гомоферментативными палочками и гетероферментативными кокками была незначительна [17].
Таким образом, решающим фактором при отборе штаммов является активность утилизации яблочной кислоты и скорость проведения яблочно-молочного брожения. По этому признаку лучшие из гомоферментативных палочек в 4-5 раз уступают гетероферментативным коккам и вряд ли окажутся перспективными для индуцированного кислотопонижения.
