Биология молочнокислых бактерий - Основные биологические свойства фагов Lact. piantarum

Изучение биологических свойств фагов молочнокислых бактерий было связано, прежде всего, с необходимостью разработки мер борьбы с фагом на предприятиях молочной промышленности.
В этом плане исследователей интересовали активность выделенных фагов, спектр антибактериального действия, термостабильность и выяснение оптимальных условий для выживания фагов и течения бактериофагического процесса. Со временем изучение биологии фагов расширялось и дополнялось сведениями о морфологии фагов, антигенных свойствах, основных фазах внутриклеточного развития.
Биология фагов молочнокислых бактерий изучена относительно слабо, причём подавляющая часть информации относится к описанию фагов молочнокислых стрептококков. Сведения о фагах к палочковидным молочнокислым бактериям скудны и эпизодичны. Отсутствует и биологическая характеристика фагов, обнаруженных в вине. Полученные нами данные, представленные ниже, несколько восполняют этот пробел [15,17].

Активность и спектр антибактериального действия

Уайтхэду X. и Коксу Г. [197] принадлежит не только приоритет в открытии явления фагии у молочнокислых бактерий, но и первые сведения о свойствах фагов молочнокислых бактерий. Выделенные ими фаги отличались низкой активностью и были высокоспецифичны, лизируя только культуры, на которых они были выделены.
Высокую специфичность отмечают Яковлев Д.А. [93] при изучении фага Str. cremoris, Сербинова Н.И. и Сокольская Е.В. [80] при характеристике фага к Lact. plantarum инфицирующих спиртовое производство, Сандайн В. и соавт. [184] фагов к Str. diacetilactis, Клерк X. и соавт. [138], Хеннинг Д. и соавт. [133], Сато Ясуси и Син Чхильнан [185], выделившие фаги из почвы, активные в отношении Str. faecalis. Практически видоспецифичным оказался вирулентный фаг, вызывающий лизис Lact. casei [153].
О поливалентных фагах сообщают Рунов Е.В. и соавт. [78], Медвинская Л.Ю. [54], Медвинская Л.Ю., Новикова С.И. [52], Гибшман М.Р. и Белоусова Н.Н. [9], Никольс К. и соавт. [160).
Непомнящая М.Л. и соавт. [59] на основании многолетних наблюдений пришли к выводу, что спектр действия фагов подвержен большой изменчивости, однако не выходит за пределы вида.
Об истинно поливалентных фагах, специфичность которых выходит за пределы вида, сообщают Козак В. и соавт. [141].
При описании фагов, выделенных из вина, указывается узкий спектр литического действия по отношению к бактериям рода Leuconostoc [127, 126, 190, 158].
Диапазон антибактериального действия является характерной особенностью штаммов фага и его обычно используют при их классификации, несмотря на то, что этот признак не является неизменным и может изменяться в результате мутации или фенотипической модификации фага [2].
Изучение нами спектра литического действия фагов Lact. plantarum (табл. 5.2) показало, что все три фага оказались видоспецифическими, не действовали на штаммы других видов и различались между собой. Выявлены наиболее чувствительные культуры, реагирующие на все три фага [2, 5, 6, 7, 18, 27, 28, 29)
При взаимодействии фагов с большей частью чувствительных культур выраженный лизис наблюдался уже через 12 часов инкубирования. Лишь в исключительных случаях ( Lp 20/5-6; Lp 20/5-18; Lp 7/4-4) лизис не сопровождался вторичным ростом, обычно на дорожке наблюдался вторичный рост, быстро усиливающийся. Часто через 24-48 часов на газоне вторичного роста возникали негативные колонии, мутные или прозрачные. При взаимодействии фага Lp 20/5 с культурами 7 и 8 выраженного лизиса в виде дорожки не наблюдалось, через 24 часа на месте дорожки возникали отдельные прозрачные негативные колонии.
Таблица 5.2
Спектр действия фагов Lact. plantarum

Морфология фагов

Фаги характеризуются большим разнообразием размеров и форм, поэтому при изучении фагов эти признаки имеют более важное значение, чем при классификации бактерий.
Анализ литературы по морфологии фагов молочнокислых стрептококков 1163, 105, 58, 199, 111, 184] показывает, что они достаточно однородны. Чаще всего это сперматозоидоподобные частицы со сферической головкой диаметром 60- 70 нм и отростком длиной 150-160 нм и шириной 20-30 нм.
Резко отличался по форме и размерам фаг Str.creriioris, описанный Вильямсоном К. и Берто В. Его сферическая головка диаметром 70-80 нм соединялась с длинным бичеподобным отростком толщиной 15 нм и длиной 560-610 нм.
Медвинской Л.Ю. [51] показаны различия двух типов фагов Str. lactis, отличающихся по всем своим свойствам. Диаметр головки фагов 1 типа был 60 нм и длина отростка 200 нм, фаг П типа имел размеры 110 нм и 220 нм соответственно.
Мытник Л.Г. и соавт. [57] при изучении умеренных и вирулентных фагов молочнокислых стрептококков отмечает идентичность их морфологии. Фаги имели головку в виде удлинённого многогранника размером 46x38 нм, отросток 8x80, заканчивающийся базальной пластиной. Коллинз Е. [107] указывает, что по форме и размерам фаги молочнокислых стрептококков сходны с хорошо известными фагами Е. coll.
Значительно большим разнообразием отличались фаги к молочнокислым палочкам, особенно умеренные фаги (табл. 5.3).
Таким образом, по имеющимся литературным сведениям, фаги молочнокислых бактерий по своей морфологии весьма разнообразны. Фаги к молочнокислым стрептококкам отличались меньшим разнообразием, чем фаги, специфичные для Lactobacillus.
Что касается фагов, выделенных из вин, то Соцци Т. и соавт. [191] в своём первом сообщении указывают на 3 морфологических типа фага: 1) фаг с длинным несокращающимся отростком; мелкие фаги с несокращающимся отростком средней длины; 2) мелкие фаги, окружённые мукополисахаридным слоем с неразличимыми капсомерами; 3) мелкий фаг с удлинённой головкой и несокращающимся отростком.

Таблица 5.3
Морфология фагов молочнокислых бактерий

Имеется лишь некоторое расширение дистальной части отростка, конец его конусообразно заострён. В месте соединения отростка фага с головкой у всех фагов наблюдается клапанообразное уплотнение. Отростки фагов имеют чёткую поперечную исчерченность. При сравнении изученных нами фагов с описанными в литературе фагами молочнокислых
Электронномикроскопические снимки изученных нами фагов выполнялись в противочумном институте "Чумин" Ростов на Дону) С.А. Токаревым и В.К. Кардеевым, за что мы приносим им глубокую благодарность.
Результаты исследования тонкой структуры фаговых частиц (фото 1,2,3) показывают, что изученные нами фаги имеют головку многогранной формы и длинный отросток без футляра, что позволяет отнести их к IV морфологической группе по классификации Тихоненко А.С. Октаэдрические головки имеют на плоскости более или менее правильную гексагональную форму. Отростки гибкие, длина их в 5-6 раз превышает диаметр головки (табл. 5.4).

Фото 1.
Морфология фага Lp 20/5.
Увеличено в 36 400 раз.

Таблица 5.4
Размеры фаговых частиц Lact. plantarum

Фото 2.
Морфология фага Lp 16/28
Увеличено в 36400 раз.
Фото 3.
Морфология фага Lp 7/6
Увеличено в 36400 раз.

У фагов Lp 20/5 и Lp 16/28 удаётся различить широкую базальную пластинку, снабженную зубцами неправильной формы. У фага Lp 7/6 бактерий отмечается относительно большая длина отростка по сравнению с диаметром головки и общая длина частиц, по которой они уступают только фагу Str. cremoris, описанному Вильямсоном К. и соавт. и имеющему длину частиц около 700 нм.

Морфология негативных колоний

Размер и морфология стерильных пятен при стандартных условиях вполне определенны для каждой системы фаг - бактерия и используются при характеристике фагов.
Изученные нами фаги различались по внешнему виду негативных колоний. При благоприятных условиях наиболее крупные колонии формирует фаг Lp 20/5 (табл. 5.5). Наиболее мелкие колонии имеет фаг Lp 16/28. Эти два фага имели типичную для умеренных фагов морфологию колоний с нечётко очерченными краями и мутным дном за счёт вторичного роста.
Фаг Lp 7/6 имел колонии с чётко очерченным краем и прозрачным дном, что характерно для С- и V-мутантов умеренных фагов. Нередко наблюдалась обратная мутация к дикому типу, когда фаг Lp 7/6 формировал типичные для умеренных фагов мутные негативные колонии. По немногочисленным литературным данным, морфология негативных колоний фагов молочнокислых бактерий не отличается разнообразием. Обычно они круглые, небольших размеров. Только Медвинской А.Ю. [53] описаны негативные колонии звёздчатой формы для фагов молочнокислых стрептококков.

Таблица 5.5
Размеры негативных колоний фагов

Морфология негативных колоний изученных нами фагов Lact. plantarum не отличалась какими-либо особенностями.

Адсорбция и основные фазы внутриклеточного развития фагов Lact. plantarum

При биологической характеристике фагов существенное внимание уделяется свойствам фага, непосредственно отражающим процесс его взаимодействия с чувствительной клеткой. Такими свойствами являются скорость адсорбции фага на клетке, величина латентного периода, то есть времени с момента внедрения фага в клетку до его выхода при лизисе клетки, и урожайность фага, под которой понимают количество фаговых частиц, образуемых при лизисе одной клетки. Эти свойства подвержены значительным изменениям и зависят от условий культивирования, среды, влияния различных факторов. При этом каждая система фаг - бактерия требует специфических условий.
Многими исследователями показано, что для адсорбции фагов молочнокислых стрептококков необходимы кофакторы. Так, Черри В. и Уотсон Д. [105] указывают на триптофан, соли кальция. Для стимуляции фаголизиса использовали ионы кальция [9,59], сульфид натрия, триптофан или оксихинолин [50], дрожжевой экстракт, пептон, кукурузный экстракт [159], лактозу [59].

При стандартных условиях величины, отражающие процесс взаимодействия фага с клеткой, вполне определенны и служат для характеристики фагов и отличия их друг от друга. Латентный период и выход фага определяют скорость развития фага в культуре и эффективность инфекционного процесса.
Сведения, касающиеся основных фаз внутриклеточного развития фагов молочнокислых бактерий, весьма скудны [105, 200, 184, 59, 107, 138, 153]. Анализ литературы свидетельствует о большом разнообразии этих свойств. Это связано, очевидно, как с системой вирус-хозяин, так и с техникой и условиями определения. Величина латентного периода для фагов молочнокислых стрептококков колебалась от 20 мин. до 90 мин. Очень большой латентный период определён для фагов Lact. casei - 100-220 мин. [138]. Сильно варьирует и урожайность фагов от 6 до 200 частиц на клетку.
Время адсорбции фага на бактериях изучали по Адамсу [2]. Результаты выражали в виде константы скорости адсорбции (К), вычисляемой по формуле:

где Ро - исходное количество фага;
Р - количество неадсорбированного фага;
t - время адсорбции;
В - концентрация бактерий, выраженная числом клеток в 1 см³.
Исследование одиночного цикла развития фага проводили по методу Эллиса и Дельбрюка [2]. Анализ динамики термоинактивации осуществлялся по методике Фридман и Коулз [117] на физрастворе. Результаты выражали в виде времени инактивации и константы скорости инактивации [14]

где t - время воздействия;
Ро - исходная концентрация фага;
Р - концентрация фага при времени t.
Установлено, что изученные нами фаги Lact. plantarum мало различались по скорости адсорбции (табл. 5.6).
Время максимальной адсорбции для всех фагов было в пределах 40 мин. при температуре 28°С. Самая низкая скорость адсорбции наблюдалась у фага Lp 20/5. Промежуточное положение по показателям адсорбции занимал фаг Lp7/6.

Таблица 5.6
Характеристика адсорбции фагов L. plantarum

Значительно большие различия обнаружили фаги в продолжительности латентного периода и величинах урожайности. По этим свойствам выделяется фаг Lp 20/ 5: у него самый короткий латентный период (260 мин.) и максимальная по сравнению с двумя другими фагами урожайность (90 частиц на клетку). Наименьшей продуктивностью обладал фаг Lp 7/6, длительность его латентного периода равнялась 360 мин, выход составлял 10 частиц на клетку [23].
Сопоставляя полученные данные с известными сведениями о фазах развития фагов молочнокислых бактерий, нужно отметить очень большую продолжительность латентного периода изученных фагов, по которой среди описанных в литературе им нет равных. Так если для фагов молочнокислых стрептококков она колебалась от 20 мин. [59] до 90 мин. [200], для фагов L. casei 100-220 мин., то для наших фагов величина латентного периода составляла 260- 360 мин. Очевидно, это связано с особенностями молочнокислых бактерий вина, являющихся их хозяевами. Что касается урожайности, то она могла быть заниженной за счёт лизогенизации части инфицированных клеток.