Образование лимонной кислоты. Известно, что многие плесени образуют лимонную кислоту в процессе потребления сахаров; это же наблюдается и у Botrytis cinerea. Впрочем, это одна из наиболее распространенных форм катаболизма грибов, связанная с респираторными явлениями, — следствие универсальности трикарбонового цикла Кребса.
Общее уравнение образования лимонной кислоты окислением сахаров имеет вид.
Как и при спиртовом брожении, первая стадия этого окисления завершается, начиная с триозофосфатов, пировиноградной кислотой. Согласно циклу Кребса лимонная кислота образуется при конденсации пировиноградной кислоты и щавелевоуксусной кислоты:
Щавелевоуксусная кислота сама, по-видимому, образуется от прямого карбоксилирования пировинограднои кислоты: 
.
На рис. 8.7 показано в зависимости от времени образование лимонной кислоты шестью штаммами Botrytis cinerea, культивируемыми на виноградном сусле.
Образование лимонной кислоты находится в тесной зависимости от рН. Так же как и у других плесневых грибов, повышение кислотности достигает максимальных значений только при высоких рН, как это показывают следующие данные, полученные при культивировании, продолжавшемся 45 дней;
Исходное значение рН 2,60 3,06 3,47 4,03 4,70 5,81 7,00
Образовавшаяся лимонная кислота, 4 8 39 59 68 84 89 мг-экв/л
Рис. 8.7. Образование лимонной кислоты культурами различных штаммов Botrytis cinerea на виноградном сусле:
Образование глюконовой и слизевой кислот. Известно, что некоторые плесени посредством фермента глюкозооксидазы способны образовывать глюконовую кислоту из глюкозы. Эта кислота получается простым окислением в карбоксильную группу альдегидной функции глюкозы
2СН2ОН — (СНОН)4 — СНО + О2 -> 2СН2ОН — (СНОН)4 — СООН.
Botrytis cinerea обладает такой глюкозооксидазой. Глюконовая кислота была обнаружена в питательных средах и во всех проверенных партиях винограда с плесенью, тогда как здоровый виноград не содержал даже следов, которые можно было бы определить посредством количественного анализа. Содержание этой кислоты в суслах из плесневелого винограда колеблется от 5 до 10 мг-экв/л, т. е. приближенно от 1 до 2 г/л. Присутствие глюконовой кислоты в сусле или вине (эта кислота не сбраживается) подтверждается вмешательством плесени.
Точно также слизевая кислота [СООН—(СНОН)4—СООН], идентифицированная Кильхофером и Вюрдигом в 1961 г. в винах из винограда, пораженного плесенью, образуется под влиянием Botrytis cinerea в результате ферментативного окисления галактуроновой кислоты. Присутствие слизевой кислоты в суслах из винограда с плесенью при концентрациях, которые могут достигать 2 г/л (Вюрдиг, 1975), по-видимому, является одной из причин образования осадка в бутылках с выдержанными ликерными винами.
Рис. 8.8. Образование глицерина культурами различных штаммов Botrytis cinerea на виноградном сусле:
1 — № 4; 2 — № 1; 3 — № 2; 4 — № 5; 5 — № 3.
Образование глицерина и других многоатомных спиртов. Лаборд установил постоянное образование глицерина грибом Botrytis cinerea, что почти одновременно подтвердил Мюллер-Тургау; его внимание было привлечено значительными количествами глицерина, содержащимися в винах района Сотерн.
На рис. 8.8 показано, по данным Шарпантье, образование глицерина культурами шести штаммов Botrytis cinerea на виноградном сусле. В других опытах содержание глицерина доходило до 77 ммоль/л.
Можно допустить, что механизм аэробного образования глицерина плесенями идентичен механизму образования его во время анаэробного сбраживания сахаров; в этом случае было бы истинное глицеринопировиноградное разложение сахаров:
.
Пировиноградная кислота метаболизируется, в то время как количество глицерина возрастает.
На рис. 8.9. показана скорость образования глицерина в зависимости от рН среды. В первые дни культивирования количества образуемого глицерина примерно одинаковы; вероятно, кислотность среды мало влияет на образование глицерина. Но через 25— 30 дней культуры при различных рН приобретают различный характер. Глицерин, образовавшийся в первое время уменьшается в результате сгорания тем быстрее, чем выше рН.
В одной из недавних работ Дюберне (1974), применяя специфический метод анализа посредством хроматографии в газовой фазе, подтвердил образование глицерина в суслах вследствие развития плесени или с помощью чистой культуры Botrytis cinerea. Кроме того, этот автор показал образование других многоатомных спиртов (эритрит, арабит, маннит), а также дисахарида дрегалозы. Цифры, приведенные в табл. 8.14 и 8.15, дают представление об этом процессе.
Рис. 8.9. Образование глицерина культурой Botrytis cinerea на виноградном сусле при различных значениях рН:
1 — 7,0; 2 — 4,3; 3 — 3,6; 4 — 3,2; В —2,7.
Таблица 8.14
Содержание жиров и многоатомных спиртов в суслах из винограда с плесенью и в соответствующих винах (Дюберне, 1974)
Примечание. КБ — определено в конце брожения; ПБ — образовалось в процессе брожения.
| Компоненты сусла и вина | Сусла из винограда | Вина из винограда | ||||||||||
здорового | пораженного плесенью, % | здорового | пораженного плесенью, % | |||||||||
5-10 | 30-50 | 75 | ||||||||||
5—10 | 30—50 | 75 | КБ | ПБ | КБ | ПБ | КБ | ПБ | КБ | ПБ. | ||
Фруктоза, г/л | 67,8 | 69,3 | 76,7 | 75,3 | 0,03 | _ | 0,05 | _ | 0,06 | _ | 0,07 | _ |
Глюкоза, г/л | 61,5 | 63,6 | 73,3 | 70,2 | 0,01 | — | 0,03 | — | 0,04 |
| 0,03 | — |
Г + Ф, г/л | 129,3 | 132,9 | 150,0 | 145,5 | 0,04 | — | 0,08 | — | 0,10 | — | 0,10 | — |
Г/Ф | 0,90 | 0,92 | 0,96 | 0,95 | — | — | — | — | — | — | — | — |
Глицерин, г/л | 0,7 | 0,8 | 1,8 | 3,4 | 5,7 | 5,0 | 7,1 | 6,3 | 9,0 | 7,2 | 11,6 | 8,2 |
Эритрит, мг/л | 21 | 40 | 59 | 72 | 57 | 26 | 73 | 33 | 87 | 28 | 116 | 44 |
Арабит, мг/л | 32 | 41 | 68 | 100 | 30 | 0 | 53 | 12 | 89 | 21 | 145 | 45 |
Маннит, мг/л | 49 | 70 | 139 | 217 | 61 | 12 | 113 | 43 | 180 | 41 | 295 | 78 |
Мезоинозит, мг/л | 400 | 476 | 569 | 639 | 410 | — | 456 | — | 452 | — | 604 | — |
Трегалоза, мг/л | 23 | 14 | 38 | 46 | 50 | 27 | 102 | 88 | 187 | 149 | 190 | 144 |
Таблица 8.15
Содержание сахаров и многоатомных спиртов в питательной среде чистой культуры Botrytis cinerea (Дюберне, 1974)
| Сусло | ||
Компоненты сусла | исходное | спустя 1 мес | спустя 2 мес |
Глюкоза, г/л | 70,2 | 67,6 | 49,6 |
Фруктоза, г/л | 71,7 | 70,2 | 58,4 |
Глицерин, г/л | 0,2 | 2,0 | 2,6 |
Эритрит, мг/л | 31,0 | 36,0 | 39,0 |
Арабит, мг/л | 36,0 | 86,0 | 570,0 |
Маннит, мг/л | 82,0 | 250,0 | 536,0 |
Мезоинозит, мг/л | 297,0 | 330,0 | 355,0 |
Трегалоза, мг/л | 69,0 | 64,0 | 131,0 |
В табл. 8.14 сусла подразделены на четыре категории: из здорового винограда, из винограда, пораженного плесенью на 5—10%; из винограда с поражением плесенью на 30—50%; из винограда, пораженного плесенью на 75%.
В табл. 8.15 показано действие чистой культуры Botrytis cinerea на виноградном сусле, анализируемой спустя 1 и 2 мес по сравнению с контролем. Во всех случаях особенно заметно образование значительных количеств арабита и маннита.
Действие Botrytis cinerea на составные части виноградной ягоды. В табл. 8.16 приведены результаты анализов, которые провели Мюллер-Тургау и Лаборд.
Ниже дан анализ намного более сложных исследований, которые Шарпантье провел на виноградниках на белых сортах Семильон и Совиньон. Здоровые ягоды и ягоды, покрытые плесенью, брали с одних и тех же гроздей, затем сортировали и прессовали раздельно в двух партиях. Очень обстоятельные аналитические данные сведены в табл. 8.17.
Таблица 8.16
Химические превращения винограда, вызываемые грибом Botrytis cinerea
По Мюллер-Тургау
| Виноград | |
Показатели | здоровый | с плесенью |
Масса 100 ягод, г | 139 | . 82 |
Содержание сахаров, г в 100 ягодах | 24 | 25 |
Кислотность, г в 100 ягодах | 1,4 | 0,6 |
Содержание сахаров, г на 100 г ягод | 17 | 30 |
Кислотность, г на 100 г ягод | 1,02 | 0,8 |
По Лаборду
Показатели, г/л | Виноград | ||
здоровый | плесневелый | заизюмленный | |
Сахара | 230 | 263 | 385 |
Кислотность | 2,5 | 2,7 | 2,2 |
Глицерин | 0 | 3,4 | 12,3 |
В первой части табл. 8.17 значения выражены на 1 л сусла, во второй части — на 100 виноградных ягод. Первая часть табл. 8.17 позволяет проследить физиологическое действие Botrytis cinerea, тогда как вторая часть представляет больший интерес с точки зрения энологии, поскольку в ней дан состав первичного сырья для производства вин.
Превращения, наблюдаемые в ягодах, по существу, те же, что были отмечены для чистых культур на виноградном сусле, но в деталях появляются значительные различия.
Состав сусла из здорового и пораженного благородной гнилью винограда
Таблица 8.17
Продолжение табл. 8.17
Условия развития гриба на жидкой питательной среде и на виноградной ягоде не являются абсолютно сравнимыми. Нужно учитывать, что виноград представляет собой орган, состоящий из клеток и, следовательно, очень гетерогенный. Вероятно, наибольшим изменениям подвергаются вакуоли периферийных клеток. Нити Botrytis cinerea проникают в виноградную ягоду неглубоко, масса мицелия остается небольшой, а воздушная вегетация — ограниченной. Наконец, нужно подчеркнуть прерывный характер развития гриба в природе вследствие чередования благоприятных и неблагоприятных условий в течение одного дня. Наблюдаемые изменения в составе сусел, служащих питательной средой, не воспроизводят в точности всего того, что происходит на ягоде.
Действие благородной гнили на сахара. Виноградные сахара почти полностью используются Botrytis cinerea. В ягодах, пораженных плесенью, всегда находят явно меньшее количество сахара в абсолютных значениях, чем в здоровых ягодах. Соотношение потребленных сахаров не перестает возрастать с удлинением срока перезревания винограда на кусте. Типичная благородная гниль достигает 35—45%. Возможно, что этот недостаток сахаров не просто результат их потребления. Нельзя исключить то, что миграция сахаров прерывается намного раньше, чем наступает омертвение винограда, вызываемое грибом. Благородная гниль вызывает значительные потери сахара в урожае на корню. При сборе здорового винограда виноградарь собрал бы дополнительно на всем винограднике в 2 раза больше сахара, чем при сборе плесневелого, увяленного винограда. Из этого следует, что производитель получает более крепкие вина и лучшего качества только путем естественной концентрации сахара и со значительными потерями его количества.
Во всех случаях отношение глюкоза — фруктоза уменьшилось по мере развития плесени, при этом глюкоза расходовалась больше, чем фруктоза.
Действие благородной гнили на кислоты. Плесень всегда проявляется в сильном понижении кислотности винограда. Исчезает больше половины содержащихся в винограде кислот; параллельно этому рН возрастает на 0,2 по сравнению с рН сока из здорового винограда.
В то же время отмечают, что сжигание, т. е. потребление кислот этим грибом, пропорционально выше, чем потребление сахаров. Botrytis cinerea оказывает действительно эффективное действие на кислоты винограда. Потеря кислотности иногда в 2 раза превышает потребление сахаров. Это обстоятельство следует особо подчеркнуть, так как с точки зрения качества очень важно, чтобы кислотность винограда была ниже, чем сахаристость.
Винная и яблочная кислоты потребляются грибом Botrytis cinerea, но не в одинаковой степени. Уменьшение содержания яблочной кислоты происходит пропорционально в 2—3 раза слабее, чем винной кислоты. В двух случаях было даже отмечено, что в винограде с плесенью яблочной кислоты немного больше, чем в здоровом винограде. Винная кислота может почти исчезнуть: в винах Сотерн согласно данным табл. 8.17 отмечают в 6 раз меньше винной кислоты в винограде, пораженном плесенью, чем в винах, полученных из здорового винограда. Следовательно, перезревание, реализуемое благородной гнилью, представляет собой отклонение от нормальных процессов созревания, которые в противоположном случае избирательно разрушают яблочную кислоту.
Редко констатируют образование на винограде in vivo лимонной кислоты, встречающейся в чистых культурах, но часто отмечают образование уксусной кислоты помимо, разумеется, какого-либо воздействия. Содержание летучей кислотности примерно 5—10 мг-экв/л встречается часто. В некоторые годы случается, что эти цифры бывают выше, но в этих случаях часто развиваются уксуснокислые бактерии на более или менее омертвевших ягодах.
Зачастую ошибочно считают, что благородная гниль винограда повышает количество растворимого пектина в результате гидролиза протопектина. Ликерные вина Сотерн получили свою известность именно благодаря очень высокому содержанию пектинов. В действительности же, как показано в табл. 8.18, для сортов Семильон и Совиньон содержание пектинов не изменяется или же оно заметно уменьшается по мере поражения винограда плесенью, особенно если учитывают концентрирование, вызываемое ею. С другой стороны, увеличивается количество камедей. Botrytis cinerea разрушает пектины и образует пектозаны. К тому же пектолитическая активность плесеней хорошо известна.
Таблица 8.18
Действие Botrytis cinerea на полисахариды винограда
Состояние винограда | Семильон | Совиньон | ||||
пектиновые вещества, г/л | пектины, г/л | камеди, г/л | пектиновые вещества, г/л | пектины, г/л | камеди, г/л | |
Зрелые ягоды | 1,22 | 0,23 | 1,00 | 1,60 | 1,04 | 0,56 |
Ягоды, полностью покрытые плесенью | 1,80 | 0,25 | 1,55 | 1,92 | 0,82 | 1,10 |
Заизюмленные ягоды | 2,54 | 0,33 | 2,21 | 2,61 | 0,48 | 2,13 |
Другое глубокое изменение, вызываемое грибом, выражается в разрушении букета, присущего сорту; оно придает вину особый характер. Нужно также указать на то, что Botrytis cinerea значительно снижает содержание аммиачного азота, присутствующего в сусле, что ведет к уровням, которые чаще всего недостаточны для хорошего брожения (см. табл. 8.13 и 8.17). Точно так же содержание некоторых активирующих веществ (в частности, тиамина или витамина B1) понижается после развития на винограде благородной гнили.
