В биохимическом явлении брожения виноградного сока наиболее существенная часть реакции, как это впервые было указано Гей- Люссаком и затем подтверждено Пастером, составляет расщепление сахара на спирт и углекислоту по упрощенной формуле.
По Гей-Люссаку 100 г сахара должны были бы дать 51,34 г спирта и 48,66 г угольной кислоты, а по Пастеру на то же количество сахара — 51,1 г спирта и 48,9 г угольной кислоты. В действительности, как впоследствии указал сам Пастер, при брожении сахара образуются кроме спирта и угольной кислоты еще глицерин и янтарная кислота, а также другие вещества в небольших количествах. По Пастеру из 100 частей сахара виноградного сока (глюкоза и левулоза) должно получиться
Как указано выше, деятельность дрожжей, выделяющих главный возбудитель брожения энзим — зимазу, протекает без доступа кислорода воздуха. Они черпают всю жизненную энергию из химического разложения молекулы сахара, а не из окислительной реакции кислорода воздуха. Это — экзотермическая реакция, сопровождающаяся сравнительно незначительным выделением тепла (28 калорий), однако несколько большим, чем при молочнокислом брожении (18 калорий) и маслянокислом (15 калорий).
Таким образом при спиртовом брожении дрожжи для поддержания своей жизнеспособности должны переработать сравнительно весьма большое количество сахара, а именно — за один день количество, во много раз превышающее вес самих дрожжей. С другой стороны, при аэробной жизни дрожжей, когда сахар под влиянием кислорода сгорает с образованием воды и угольной кислоты (C6Н12O6+6O2=6СO2+6H2О), выделяются 674 калории. По новейшим данным цифры, указанные Пастером, не точны и не постоянны. Они варьируют в зависимости от температуры брожения и работоспособности различных рас дрожжей.
Образование глицерина, как показали исследования Эрлиха и Принсгейма, по-видимому не связано исключительно с жизнедеятельностью дрожжей и выделяемой ими зимазы, а является продуктом распада белковых веществ. К тому же заключению пришел Вортманн, который установил, что нет прямой зависимости образования глицерина от количества образовавшихся дрожжей и что его главный источник — в составе самого сусла.
По Эрлиху янтарная кислота также не является прямым продуктом брожения, так как она образуется из глутаминовой кислоты с выделением аммиака.
В дальнейшем изложении мы еще вернемся к этим побочным продуктам, образующимся в ряде химических реакций, сопровождающих брожение, равно как и к образованию других соединений (муравьиной, пропионовой, уксусной, масляной кислот, высших спиртов, альдегидов, эфиров и пр.), влияющих главным образом па запах (букет) вина.
В противовес упрощенному выражению реакции протекающего расщепления сахаров (по Пастеру), сыгравшему значительную роль в понимании этого процесса в прошлом, мы должны уделить внимание новейшим теориям и главным образом многочисленным работам о промежуточных продуктах спиртового брожения проф. С. Костычева. Его взгляды основаны на опытно-исследовательских данных, полученных в течение целой серии лет (1903 — 1920), и основаны главным образом на предположении, что этиловый спирт образуется путем восстановления уксусного альдегида, который, следовательно представляет собой предпоследний продукт спиртового брожения.
В опытах С. Костычева при брожении в присутствии слабых растворов солей цинка и кадмия было вызвано в бродящей среде накопление уксусного альдегида (СH3СНО), выход которого достигает 1/2 выхода спирта. Далее было установлено, что дрожжи способны энергично восстанавливать уксусный альдегид в этиловый спирт. Это восстановление иногда происходит присоединением к уксусному альдегиду водорода, но в других случаях альдегид по Канницаро претерпевает перегруппировку в спирт и уксусную кислоту согласно следующей схеме:
Это наблюдение ведет к пониманию образования уксусной кислоты в качестве побочного продукта брожения.
Дрожжи, как далее указывает С. Костычев, восстанавливают все альдегиды в соответствующие спирты. Это — общая реакция для альдегидной группы.
Доказательством того, что образование уксусного альдегида предшествует образованию спирта, служит метод Канштейна и Людекса (1915) для получения глицерина из сахара при посредстве дрожжей. Для этой цели брожение ведется в присутствии Na2SaO3; альдегид, связывается в виде бисульфитного производного, глицерин же накопляется одновременно в равном молекулярном количестве (этим способом Германия получала глицерины во время империалистической войны). Здесь реакция идет следующим образом:
1 Проф. С. Костычев. Физиология растений. 1934
Накопление альдегида было выявлено С. Костычевым еще следующим способом: он добавлял к убитым дрожжам бродившей жидкости метиленовую синьку, вообще жадно связывающую водород, который таким образом отходил к ней; альдегид же частью накоплялся, а большею частью превращался в уксусную кислоту и уксусный эфир.
Накопление альдегида было выявлено также и в том случае, если брожение велось в слабощелочной среде. При этом по Канницаро значительная часть альдегида превращалась в спирт и уксусную кислоту.
С. Костычевым отмечается еще экспериментальное накопление уксусного альдегида и глицерина при внесении в бродящую жидкость значительного количества животного угля, причем механизм этой реакции пока остается не разъясненным. По авторитетному мнению цитируемого автора совокупность подавляющего количества результатов, полученных при помощи указанных здесь приемов, не оставляет сомнений в том, что уксусный альдегид — действительно промежуточный продукт спиртового брожения.
Дальнейшее стремление к объяснению механизма реакций в бродящих жидкостях поставило вопрос, какое же именно вещество предшествует образованию уксусного альдегида. В данном случае С. Костычев остановил свое внимание на предположении, что уксусный альдегид образуется из пировиноградной кислоты (СH3СОСООН), так как дрожжи бурно разлагают ее на уксусный альдегид и углекислоту
Образующийся альдегид для превращения в спирт должен присоединить 2 атома водорода.
Таким образом теория брожения на основании экспериментальных данных дает формулировку происходящих реакций по следующей схеме:
В кислой среде реакции быстро сменяют друг друга, и мы видим только образование конечных продуктов спирта и угольной кислоты. В нейтральной же среде невидимому вследствие более замедленного течения реакций каждая реакция идет при наступлении следующей, и вследствие этого возможно улавливание промежуточных продуктов.
Схема реакции разложения молекулы сахара по Костычеву, Нейбауеру и Фромезу, устанавливающая прямое образование из гексозы 2 молекул пировиноградной кислоты и 2 молекул водорода и одновременное образование уксусного альдегида, на который переносится восстанавливающее действие водорода для конечного образования этилового спирта и угольной кислоты, вносит ясность и простоту в сущность явления; тем не менее это течение реакции с теоретической точки зрения не объясняет того, как из молекулы сахара прямо образуются 2 молекулы пировиноградной кислоты.
Нейберг и его биохимическая школа высказывают предположение об образовании промежуточного продукта между гексозой и пировиноградной кислотой—метилглиоксаля (СH3—СО—СНО) (альдегида пировиноградной кислоты), получающегося быть может отщеплением воды от глицеринальдегида (СH2ОНСНОН—СНО).
Образование метилглиоксаля за последнее время доказано Нейбергом эмпирически следующим образом: если взять дифосфатгексозу (как питательный материал) и высушенные дрожжи (как энзимный материал), то можно получить в большом количестве метилглиоксаль. При этом выяснилось, что с увеличением количества дрожжей количество метилглиоксаля все уменьшается, но зато увеличивается количество образующейся пировиноградной кислоты.
В одной из своих последних работ Нейберг (в сотрудничестве с М. Кобель) подтверждает образование метилглиоксаля при введении малого количества дрожжей для обсеменения бродящей среды и устанавливает ранее указанный факт, что с увеличением количества дрожжей метилглиоксаля найти уже нельзя, но что на его место появляется пировиноградная кислота. Это происходило при обыкновенном анаэробном брожении как с живыми дрожжами, так и с высушенными, измельченными, действовавшими выделенной из разрушенных клеток зимазой.
Таким образом в лице Нейберга мы видим сторонника теории образования промежуточного метилглиоксаля в цепи реакций сбраживания сахара в спирт и углекислоту.
В заключение нельзя не остановить внимания на предположении, усматривающем возможность появления наряду с пировиноградной кислотой еще и муравьиной (СH2O2). Этот взгляд предполагает сложное превращение метилглиоксаля в муравьиную кислоту и уксусный альдегид. Что же касается образования муравьиной кислоты за счет сахаров и расщепления ее на углекислоту и водород живыми дрожжевыми клетками, — это факт, установленный давно (Гоппе-Зейлером в 1883 г). В данном случае отщепляющийся водород может получить направление для восстановления уксусного альдегида в алкоголь. Тем не менее эта гипотеза, предполагающая одновременное образование метилглиоксаля, муравьиной кислоты и уксусного альдегида, экспериментально еще слабо обоснована.
Подводя итог приведенным выше гипотезам о расчлененном ходе реакции брожения сахара, считаем нужным остановиться на выражении их в схеме, согласованной с новейшими воззрениями экспериментальной школы Костычева и Нейберга:
